Đề tài Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme amylase từ vi sinh vật Asp.nigerbằng phương pháp lên men bề mặt, công suất 5000 tấn/năm

Mục lục Lời mở đầu Công nghệ sinh học là nền tảng của nên kinh tế tri thức, thu hút nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ tế bào, công nghệ enzyme và protein, công nghệ vi sinh vật, công nghệ lên men, công nghệ môi trường, Ngành công nghệ enzyme được phát triển mạnh từ những năm 1960, nhờ ứng dụng công nghệ lên men vi sinh vật và gần đây hơn là nhờ thành tựu của công nghệ di truyền. Ngày nay, việc khai thác và sử dụng enzyme không còn là quá trình thủ công, mang tính chất truyền thống mà đã phát triển thành một ngành công nghiệp với những kỹ thuật hoàn chỉnh và đem lại lợi nhuận không nhỏ. Năm 1980, chế phẩm amylase được sản xuất được sản xuất đến 320 tấn. Năm 1984-1990, người ta đã tiêu tốn 15-20 triệu USD cho nhu cầu sử dụng enzyme này. (2) Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Đó là lợi thế giúp cho ngành công nghiệp sản xuất enzyme phát triển mạnh mẽ. Chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc có vai trò đặc biệt quan trọng đối với rượu cồn, thực phẩm lên men, công nghiệp dệt, sản xuất thức ăn gia súc và cả trong y học. Chính vì vậy tôi chọn đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme amylase từ vi sinh vật Asp.nigerbằng phương pháp lên men bề mặt, công suất 5000 tấn/năm vớiđộ đậm đặc tăng gấp 10 lần so với sản phẩm lên men thô. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về enzyme amylase Enzyme amylase: Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong giới sinh vật, xúc tác thủy phân tinh bột thành đường. Enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực khác đặc biệt là công nghệ thực phẩm. Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột có thể chia amylase thành các loại sau: α-amylase (1) α-amylase là một enzyme có phân tử lượng thấp, nằm trong khoảng từ 50.000 đến 60.000 Dal. Cấu trúc không gian của α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên, song với tốc độ rất chậm. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose hoặc dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Một số tính chất của enzyme amylase: pH tối thích cho enzyme α-amylase từ nấm sợi là 4.0-4.8. Đặc biệt enzyme α-amylase từ Asp.nigercó thể chịu được pH=2.5-2.8. Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50ºC và bị vô hoạt ở 70ºC (Kozmina, 1991). α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6- glucosidase của amylopectin nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. β- amylase: Cấu trúc phân tử β-amylase β- amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. β- amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α- 1,4- glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose có cấu hình β vì thế enzyme này được gọi là enzyme β- amylase. Tác dụng của β- amylase lên hồ tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Tinh bột -------------->maltose (54-58%) + β- dextrin (42-46%) β- amylase là một abumin, trung tâm xác tác chứa nhóm –SH, nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histindine. β- amylase không bền khi có Ca2+. β- amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+ , urea, iodine, ozon, β- amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid. Nhiệt độ tối thích của β- amylase là 55ºC, nó bị bất hoạt ở 70ºC. pH tối thích 5.1-5.5. γ- amylase (glucoamylase): Cấu trúc phân tử glucoamylase γ- amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillum, Rhizopus. γ- amylase từ phân tử nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000Dal. γ- amylase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thủy phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thủy phân được các liên kết α-1,5 và α-1,3 nhưng rất chậm. γ- amylase có thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các enzyme khác. γ- amylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các phân tử nhỏ. Đa số các γ-amylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3.5-5.5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone. Oligo-1,6- glucosidase: Cấu trúc oligo-1,6-glucosidase Enzyme này có thể thủy phân liên kết α-1,6- glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Oligo 1,6-glucosidase có nhiều trong các vi sinh vật đồng thời cũng có nhiều trong các hạt nảy mầm. Nhiệt độ tối thích cho enzyme này là 40ºC và pH tối thích là 5.1. α - dextrin-6-glucosidase (pullulanase): Enzyme này có thể thủy phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ chất này đên đường lên men được. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân những dextrin phân tử thấp chỉ gồm 2 gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng đồng thời của α-amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn. Cấu trúc pullulanase α – glucosidase hay maltase: Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu. Ứng dụng (2) Trong công nghiệp sản xuất rượu bia: Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng amylase từ malt để thủy phân tinh bột ở giai đoạn đường hóa. Như vậy cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và giá thành sản phẩm. Để khắc phục điều này, các nhà sản xuất sử dụng chế phẩm enzyme amylase thay thế một phần malt. Nhờ vậy, giá thành của sản phẩm được giảm trong khi đó sản phẩm vẫn giữ được đặc trưng của bia. Trong công nghiệp sản xuất rượu từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng một nguồn nguyên liệu khác nhau. Ở Mỹ, người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mỳ, ở nước ta và một số nước khác sử thì sử dụng gạo. Trong giai đoạn đường hóa người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase. Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trính đường hóa để sản xuất rượu sake cách đây hơn 1700 năm. Ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay cho amylase của malt trong sản xuất bia. Nhờ sự du nhập này mà người Mỹ đã tiết kiệm được chi phí khổng lồ cho công nghiệp sản xuất rượu, bia. Trong sản xuất bánh mỳ Đây là ngành tiêu thụ một lượng lớn tinh bột và enzyme thủy phân tinh bột. Amylase được thêm vào trong hỗn hợp bột để phân giải tinh bột thành các dextrin ngắn hơn và những dextrin này sẽ được lên men. Sự thêm malt và amylase vào hỗn hợp bột làm tăng thể tích và cải thiện kết cấu sản phẩm nướng. Từ lúc bắt đầu, amylase được thêm vào trong suốt quá trình chuẩn bị bột nhão để sinh ra những hỗn hợp lên men. Bên cạnh việc sinh ra hỗn hợp lên men, amylase cũng có tác dụng chống ôi trong việc nướng bánh mỳ và duy trì độ mềm mịn cho sản phẩm nướng (Olesen, 1991). Trong chế biến thức ăn gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tang hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột người ta thường cho them enzyme amylase vào. Enzyme này sẽ tham gia vào quá trình phân giải tinh bột thành đường, giúp quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. Trong công nghiệp dệt Ngươi ta sử dụng enzyme amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho mềm vải. Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, để làm mềm vải và tang khả năng nhúng nước, người ta dung enzyme từ vi khuẩn hay nấm mốc. Phương pháp dung enzyme không làm tổn hại vải, độ mao dẫn tốt, đảm bảo vệ sinh. Trong y học Amylase cùng các enzyme khác được dùng trong y học để làm thuốc chữa một số bệnh do thiếu enzyme, kém khả năng chuyển hóa vật chất, bệnh về tiêu hóa, thần kinh, Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP để điều chế thuốc trị bệnh tim mạch, thần kinh, Tổng quan về nấm mốc Asp.niger và phương pháp lên men bề mặt Asp.niger [3] Giống Aspergilluscó khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, có giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ, VanTieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Asp.niger từ hạt chứa nhiều dầu như hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc, ngô, Asp.niger cũngđược phân lập từ các sản phẩm lên men cổ truyền. (Lương Đức Phẩm, 2004) Lịch sử phát hiện Giống Aspergillus do Michelli lần đầu tiên được mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. Raper và Fennell (1965) chỉ dung một số tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần. Như vậy, Asp.niger có vị trí phân loại như sau: Lớp: Deuteromyces Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceace Giống: Aspergillus Đặc điểm hình thái: Dưới kính hiển vi nấm Asp.nigercó khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu 5-6 x 20-30mm, đôi khi 6-10 x 60-70mm. Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4-5mm. Asp.niger trên đĩa thạch Bào tử Asp.niger Đặc điểm sinh học: Asp.nigerlà vinh sinh vật hiếu khí bắt buộc, dị dưỡng hóa năng, sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8ºC, tối đa 45-47ºC, tối ưu 25-28 ºC, độ ẩm tối thiểu 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 60-65%. Asp.nigersinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4-6,5. Tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng Asp.nigersinh trưởng được ở pH=2. Trên môi trường thạch Czapek, Asp.nigermọc thưa, đường kính khuẩn lạc khoảng 4cm. Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc Asp.nigermọc tốt và to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 6cm. Trên môi trường thạch malt, khuẩn lạc mọc tốt nhưng không to như trên môi trường thạch Czapek-cao nấm men. Đặc điểm sinh hóa: Khả năng lên men đường: Asp.nigercó khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như: glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose. Asp.niger đồng hóa được galactose, lactose ở mức độ kém hơn. Khả năng tổng hợp enzyme: α- amylase: Asp.niger có khả năng tổng hợp α- amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo thành dextrin và một ít maltose và glucose. Protease:Asp.niger có khả năng tạo thành 2 loại protease. Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin. Cellulase:Asp.nigercó khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx và b-glucosidase hay cellobiase. Pectinase, Xylanase:Asp.nigercó khả năng tạo pectinase, xylanase ở nhiệt độ tối thích 25 độ C, pH 5,6. Ngoài ra, Asp.niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipase, mananase. Nguồn dinh dưỡng của Asp.niger Thành phần dinh dưỡng là yếu tố có tác dụng quan trọng đến hoạt động sống của vi sinh vật và khả năng sinh tổng hợp enzyme. Đứng trên quan điểm điều khiển khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm có chủ đích thì thành phần môi trường dinh dưỡng phải đáp ứng được yêu cầu chính là phải có độ hoàn thiện đảm bảo. Trong môi trường dinh dưỡng phải có đủ các chất đảm bảo sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Vi sinh vật cần phải được cung cấp đầy đủ các chất chứa các nguyên tố: C, O, H, N, S,... Ngoài ra môi trường còn phải có các khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, có trường hợp người ta còn bổ sung thêm acid amin. Nguồn thức ăn Carbon: Nấm mốc có thể sử dụng khoảng 75 hợp chất không chứa Nitơ. Tinh bột, dextrin, maltose với nồng độ thích hợp là những chất cảm ứng sinh tổng hợp hệ enzyme amylase. Ảnh hưởng của nguồn Carbon tới cường độ sinh tổng hợp enzyme amylase theo thứ tự sau: Tinh bột > dextrin >Maltose >Saccharose > Glucose >Lactose >Arabinose > Galacose > Manose Cám gạo: Cám gạo là một phế phẩm khi xay xát hạt lúa để loại bỏ lớp vỏ tạo ra hạt gạo. Trong cám gạo có chứa tương đối đủ các chất phù hợp cho sự phát triển của vi sinh vật đặc biệt là nấm sợi, hàm lượng tinh bột chiếm lượng lớn. Thành phần hóa học của cám (Gene và ctv, 2002) STT Thành phần Đơn vị Số lượng 1 Protein % 12,20 2 Lipit % 22,70 3 Gluxit tổng số % 40,30 4 Cellulose % 6,30 5 Tro % 6,50 6 Canxi mg/100g 30,00 7 Photpho mg/100g 4,60 8 Sắt mg/100g 14,00 9 Vitamin B1 mg/100g 0,96 Trấu: Trấu là phế liệu trong công nghiệp xay xát, thành phần chủ yếu của trấu là chất xơ. Trấu bổ xung vào môi trường chỉ có tác dụng làm tăng độ xốp cho môitrường để tạo điều kiện thông khí tốt, người ta thường trộn trấu cho vào với tỷ lệ khoảng 20% ÷ 25%. Bã đậu nành: Là phế liệu thu được khi xay nhuyễn phần đậu đã tách ép lấy dầu thông qua quá trình tinh chiết. Giá trị dinh dưỡng của bã đậu nành (4) Thành phần Phần trăm (%) Chất khô 89 Protein thô 48 Chất xơ thô 0.3 Chất xơ trong quá trình chế biến 0.7 Nguồn thức ăn Nitơ: Nguồn Nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Tỷ trọng giữa Cacbon và Nitơ trong môi trường có ý nghĩa lớn đối với vi sinh vật và sự tạo thành amylase. Thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn Nitơ. Nguồn Nitơ hữu cơ thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó. Nguồn thức ăn khoáng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme, thiếu Mg2+ sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase của nấm mốc. Nguồn Mg2+ thường được sử dụng là MgSO4. Photpho cần để tổng hợp các thành phần quang trọng của sinh chất (axit nucleic, photpholipit) và nhiều co-enzyme, đồng thời để phosphoride hóa gluxit trong quá trình oxy hóa sinh học. Nguồn photpho thường là KH2PO4. Chương 2 CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN THIẾT BỊ Chọn dây chuyền công nghệ Làm nguội Giống gốc Hoạt hóa giống Nhân giống sản xuất Phối trộn Thanh trùng (140oC) Lên men Nghiền mịn Trích ly Cô đặc chân không Chế phẩm enzyme thô Lọc Làm sạch, định lượng Cám gạo Trấu Làm sạch, định lượng Bã đậu nành Nghiền mịn, định lượng Bao gói Nước Bã Thanh trùng khay Khay Nước Thuyết minh dây chuyền công nghệ Nguyên liệu Nguyên liệu cám gạo Cám gạo được gàu tải vận chuyển lên bunke chứa, sau đó được vít tải vận chuyển từ bunke đến sàng phân loại. Cám gạo đạt yêu cầu được vít tải vận chuyển đến máy trộn. Nguyên liệu trấu Trấu được gàu tải lên bunke chứa, sau đó được vít tải vận chuyển đến máy trộn. Nguyên liệu bã đậu nành Bã đậu nành được gàu tải lên bunke chứa. Sau đó vít tải vận chuyển bã đậu nành từ bunke đến máy nghiền. Sau khi nghiền xong, vít tải vận chuyển bã đậu nành đến máy trộn. Phối trộn Mục đích: Trộn đều môi trường dinh dưỡng. Hỗn hợp cám gạo, bã đậu nành, trấu, chất khoáng,và các chất dinh dưỡng cần thiết được trộn đều. Hoạt tính amylase và hàm lượng protein cao nhất (358,552 UI/g CT và 41,484mg/g) ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 2:1:1. Hàm lượng và hoạt tính amylase ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 1:2:1 cũng khá cao. Môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 1:1:2 cho hàm lượng và hoạt tính amylase thấp.(5) Thanh trùng Mục đích: cám và các nguyên liệu khác có chứa nhiều VSV, để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường cần phải thanh trùng. Tiến hành: hấp thanh trùng dưới áp suất hơi 1÷ 1.5atm, nhiệt độ 140˚C thời gian 45-50 phút. Làm nguội Mục đích: Hạ nhiệt độ của nguyên liệu để nấm men có thể sinh trưởng và phát triển thuận lợi. Tiến hành: Sau khi hấp thanh trùng, môi trường được chuyển qua băng tải làm nguội đến nhiệt độ khoảng 38÷ 40˚C. Thời gian làm nguội phải ngắn để hạn chế sự nhiễm VSV. Nhân giống sản xuất Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy truyền mỗi tháng một lần trong các môi trường thạch sapec. Thành phần môi trường thạch sapec: Nước 1000ml Saccroza 30g NaNO3 3g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g KCL 0.5g FeSO4 0.01g 10 ml dịch tự phân nấm men. pH = 4 ÷ 5 Nhân giống trên máy lắc. Cũng môi trường trên mốc giống được nuôi trong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc. Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển qua phòng nhân giống để nhân giống sản xuất. Gieo giống Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ 35oC ÷ 40oC ta tiến hành gieo giống, tỷ lệ gieo giống là 10%. Sau đó trộn đều môi trường dinh dưỡng và giống. Trộn đều giống và môi trường dinh dưỡng Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được gàu tải chuyển lên bunke trung gian. Từ bunke này canh trường qua vít tải định lượng đồng thời được chuyển đến máy trộn để trộn đều giống và môi trường dinh dưỡng. Lên men Sau khi trộn đều, canh trường được đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy và tiến hành nuôi. Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường. Đây là môi trường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi trường. Độ ẩm 58% ÷ 60%. Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là 42 giờ. Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này thường kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Trong giai đoạn này có những thay đổi sau: + Nhiệt độ tăng chậm. + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. + Khối môi trường còn rời rạc. + Enzyme mới bắt đầu hình thành. Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không được để nhiệt độ cao hơn 30˚C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 ÷ 18 giờ tiếp theo. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường. + Môi trường được kết lại khá chặt. + Độ ẩm của môi trường giảm dần. + Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 40˚C ÷ 45˚C . + Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá của nấm sợi. + Các loại enzyme được hình thành, trong đó enzyme amylase hình thành nhiều nhất. + Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 29˚C ÷ 30˚C. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 20 giờ tiếp theo. Ở giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó quá trình giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. + Nhiệt độ khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống còn 20% ÷ 25% thể tích không khí trong 1 giờ. Nhiệt độ nuôi cấy duy trì ở 30oC. Cần dừng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này. Vì trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme. Nghiền mịn Mục đích : vừa phá vỡ tế