Đề tài Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen

MỞ ĐẦU Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thu nhập của người dân ở các nước này. Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quan trọng và hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm [11]. Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và gia súc. Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệu liều vaccine được dùng. Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới). Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có tiềm ẩn bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất [33]. Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải. Theo số lượng thống kê của Viện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phố có 82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế. Nhưng hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine là phương pháp tối ưu nhất. Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổ biến là loại vaccine bất hoạt. Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao, không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccine hoàn toàn mới. Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơn giản có thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so với vaccine cổ điển. Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng khác nhau như E. coli, nấm men… người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế hệ mới. Nhưng đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong các tế bào vi sinh vật lại gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trên các đối tượng cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá…) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì tính hiệu quả của nó. Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đối tượng cây trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất trên tế bào động vật. Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuật đơn giản phù hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển. Hơn thế nữa, vì là vaccine ăn hoặc uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng và bảo quản [1, 13]. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật, nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uống được. Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. Giíi thiÖu chung vÒ Vaccine 1.1.1. Vaccine vµ hiÖu qu¶ phßng chèng bÖnh truyÒn nhiÔm KÓ tõ khi Edward Jenner (1749-1823) t×m ra ph­¬ng ph¸p tiªm chñng mñ ®Ëu mïa bß cho ng­êi ®Ó phßng bÖnh ®Ëu mïa ®Õn nay ®· h¬n 200 n¨m. Cho ®Õn nay vaccine vÉn ®­îc coi lµ thµnh tùu vÜ ®¹i nhÊt cña y häc hiÖn ®¹i. C«ng t¸c tiªm chñng ®· ®­îc thùc hiÖn ë tÊt c¶ c¸c quèc gia trªn thÕ giíi vµ trë thµnh mét tÊm l¸ ch¾n h÷u hiÖu chèng l¹i nhiÒu bÖnh truyÒn nhiÔm nguy hiÓm do virus g©y ra. Nhê cã vaccine mµ hµng tr¨m triÖu ng­êi trªn thÕ giíi ®· tho¸t khái bÖnh tËt vµ thÇn chÕt. Vaccine lµ chÕ phÈm kh¸ng nguyªn chØ g©y ph¶n øng miÔn dÞch mµ kh«ng g©y bÖnh. Vaccine dïng ®Ó kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch nguyªn ph¸t lµm t¨ng tÕ bµo ghi nhí vµ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch ghi nhí khi tiÕp xóc víi kh¸ng nguyªn Êy trong t­¬ng lai. Kh¸ng nguyªn kh«ng nhÊt thiÕt ph¶i lµ toµn bé h¹t virus, chóng cã thÓ chØ lµ mét bé phËn cña virus cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch c¬ thÓ s¶n xuÊt kh¸ng thÓ hoÆc xytokin trung hoµ virus [2]. §èi víi c¸c n­íc ®ang ph¸t triÓn, vaccine ®­îc coi lµ biÖn ph¸p phßng vµ ch÷a bÖnh hiÖu qu¶ nhÊt, do t¹i ®©y bÖnh truyÒn nhiÔm vÉn cßn lµ c¨n bÖnh nguy hiÓm, ch­a cã thuèc ®iÒu trÞ ®Æc hiÖu hoÆc nÕu cã th× gi¸ thµnh l¹i qu¸ cao so víi thu nhËp cña ng­êi d©n. Cßn víi nh÷ng n­íc ph¸t triÓn, t×nh h×nh m¾c bÖnh truyÒn nhiÔm vµ tû lÖ tö vong do bÖnh nµy ®· gi¶m ®¸ng kÓ, ë mét sè n­íc, tû lÖ tö vong chØ cßn chiÕm 4 - 8% tæng sè c¸c tr­êng hîp tö vong. §iÒu nµy kh«ng cã nghÜa lµ vaccine kh«ng cßn quan träng ë c¸c n­íc nµy n÷a. Thùc tÕ cho thÊy r»ng, tû lÖ bÖnh truyÒn nhiÔm gi¶m ®¸ng kÓ lµ nhê viÖc sö dông mét c¸ch réng r·i vaccine cho viÖc phßng chèng bÖnh trong nhiÒu thËp kû qua. VÝ dô cô thÓ ®èi víi bÖnh ®Ëu mïa, n¨m 1967 cã tíi h¬n m­êi triÖu ng­êi m¾c, bÖnh nµy ®· lan truyÒn trªn 30 n­íc, nh­ng ®Õn nay nhê viÖc sö dông vaccine trong nhiÒu n¨m mµ ng­êi ta ®· lo¹i bá ®­îc hoµn toµn c¨n bÖnh nµy [2]. ë ViÖt Nam, sau mét thêi gian dµi thùc hiÖn viÖc tiªm chñng liªn tôc, vµo n¨m 2000 chóng ta ®· tuyªn bè víi c¶ thÕ giíi vÒ viÖc ®· thanh to¸n xong bÖnh b¹i liÖt. HiÖu qu¶ cña viÖc sö dông vaccine kh«ng chØ giíi h¹n ë mÆt phßng vµ ch÷a bÖnh mµ cßn rÊt cã lîi vÒ mÆt kinh tÕ. Chi phÝ cho tiªm chñng rÎ h¬n rÊt nhiÒu so víi ®Ó cho ng­êi d©n m¾c bÖnh rèi míi ch÷a. C¸c thuèc kh¸ng sinh còng nh­ ho¸ trÞ liÖu th­êng rÊt ®¾t tiÒn, ®Êy lµ ch­a kÓ tíi chi phÝ vÒ ®i l¹i, gi¶m n¨ng suÊt lao ®éng, g©y ra t¸c dông phô còng nh­ gia t¨ng chi phÝ vÒ dÞch vô y tÕ [9]. Bªn c¹nh ®ã vaccine cßn cã vai trß quan träng trong ngµnh thó y, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c¬ së ch¨n nu«i cã mËt ®é gia sóc cao lµm cho kh¶ n¨ng l©y nhiÔm gia t¨ng nhanh chãng. NhÊt lµ trong t×nh tr¹ng hiÖn nay, chóng ta ®ang ph¶i ®èi phã víi nhiÒu lo¹i dÞch bÖnh g©y tæn thÊt nÆng nÒ cho nªn kinh tÕ quèc d©n, ®iÓn h×nh lµ bÖnh cóm gia cÇm xuÊt hiÖn gÇn ®©y ë n­íc ta [4]. HiÖn nay, nhiÒu lo¹i accine gi¶m ®éc lùc vµ vaccine bÊt ho¹t ®ang ®­îc sö dông ®Ó dù phßng nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau. VÊn ®Ò ®¸ng lo ng¹i lµ c¸c vaccine sèng gi¶m ®éc lùc gÆp ph¶i lµ sù phôc håi trë l¹i kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña chóng. Ch¼ng h¹n nh­ vaccine Sabin (vaccine gi¶m ®éc lùc ®Ó phßng bÖnh b¹i liÖt), tr×nh tù axit nucleic cña chñng vaccine vµ chñng hoang d¹i chØ kh¸c nhau cã hai nuclªotit v× vËy theo thêi gian chóng cã thÓ ®ét biÕn ng­îc trë l¹i thµnh chñng hoang d¹i cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh. Theo thèng kª gÇn ®©y cho thÊy, tõ n¨m 1973 ®Õn n¨m 1984 khi sö dông vaccine Sabin ®Ó phßng bÖnh b¹i liÖt, cø 520 ngh×n tr­êng hîp sö dông th× cã mét tr­êng hîp m¾c bÖnh b¹i liÖt do virus ®ét biÕn ng­îc trë l¹i. Cßn cã mét ®iÒu nguy hiÓm n÷a lµ vaccine gi¶m ®éc lùc lµ c¸c virus sèng, chóng cã thÓ nh©n lªn hoÆc tån t¹i d­íi d¹ng tiÓm Èn trong c¬ thÓ vµ cã thÓ g©y hËu qu¶ nghiªm träng trong t­¬ng lai. Mét nguy c¬ n÷a lµ, t¸c nh©n gi¶m ®éc lùc dïng trong s¶n xuÊt vaccine tuy kh«ng cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh ®èi víi c¬ thÓ ng­êi khoÎ m¹nh nh­ng l¹i vÉn cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh ®èi víi ng­êi bÞ suy gi¶m miÔn dÞch. Do ®ã, ®èi víi mét sè n­íc ®ang ph¸t triÓn, vÉn ®Ò sÏ lµ rÊt ®¸ng lo ng¹i nÕu cã nhiÒu trÎ em bÞ suy gi¶m miÔn dÞch do suy dinh d­ìng ®­îc dïng lo¹i vaccine nµy [6]. C«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp vµ ph­¬ng ph¸p tæng hîp b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc cã vai trß rÊt lín trong viÖc kh¾c phôc nh÷ng vÊn ®Ò trªn, cho phÐp chóng ta s¶n xuÊt ®­îc c¸c vaccine phßng bÖnh mµ ®èi víi ph­¬ng ph¸p cæ ®iÓn kh«ng thÓ t¹o ra ®­îc. 1.1.2. Vaccine t¸i tæ hîp Cïng víi sù ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ sinh häc, cã rÊt nhiÒu lo¹i vaccine míi ®­îc t¹o thµnh. Nh÷ng lo¹i vaccine nµy ®· kh¾c phôc ®­îc nh÷ng bÊt lîi cña c¸c lo¹i vaccine cæ ®iÓn vµ cã hiÖu lùc cao h¬n, chóng ®­îc gäi lµ vaccine t¸i tæ hîp. Vaccine t¸i tæ hîp kh«ng ®­îc s¶n xuÊt theo c¸ch th«ng th­êng, chóng ®­îc s¶n xuÊt ra tõ mét lo¹i c¬ thÓ sèng cã thÓ ®­îc xem lµ hoµn toµn v« h¹i. §Ó t¹o ra ®­îc mét lo¹i vaccine t¸i tæ hîp tr­íc hÕt ng­êi nghiªn cøu ph¶i x¸c ®Þnh ®­îc ph©n tö nµo t¹o ra ®¸p øng miÔn dÞch ®Æc hiÖu, nh÷ng ph©n tö nµy cã thÓ lµ c¸c protein, glycoprotein hoÆc thËm chÝ lµ mét ®o¹n ph©n tö ADN (DNA vaccine). Ph­¬ng ph¸p ADN t¸i tæ hîp cã thÓ ®­îc sö dông ®Ó t¹o ra hµng lo¹t ph©n tö nµy trong nh÷ng vi sinh vËt v« h¹i nh­ E. coli, nÊm men hoÆc tÕ bµo ®éng vËt víi c¸c vect¬ lµ c¸c virus kh«ng g©y bÖnh nh­ Baculovirus, Vaccinia virus, Adenovirus [4]. B»ng ph­¬ng ph¸p nµy, ng­êi ta cã thÓ t¹o ra ®­îc vaccine ngay c¶ khi c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh kh«ng thÓ nu«i cÊy ®­îc hoÆc c¸c t¸c nh©n cã thÓ nu«i cÊy ®­îc nh­ng trong ®iÒu kiÖn rÊt khã kh¨n ®ßi hái chi phÝ tèn kÐm. Kh«ng nh÷ng thÕ, vaccine t¸i tæ hîp cã kh¶ n¨ng g©y ®¸p øng miÔn dÞch ®Þnh h­íng víi tõng thµnh phÇn cña virus, æn ®Þnh, cã thÓ kh«ng cÇn b¶o qu¶n l¹nh vµ rÊt an toµn v× gen ®éc ®· ®­îc lo¹i trõ [27]. C¸c vaccine thÕ hÖ míi bao gåm: Vaccine d­íi ®¬n vÞ (subunit vaccines) chØ chøa mét sè ph©n tö nhÊt ®Þnh cña t¸c nh©n g©y bÖnh, vÝ dô nh­ vaccine viªm gan B ®­îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp ®ang ®­îc sö dông réng r·i trªn thÕ giíi, hoÆc vaccine ADN lµ nh÷ng ph©n tö ADN cã kh¶ n¨ng g©y ph¶n øng miÔn dÞch. MÆc dï, c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp vµ ph­¬ng ph¸p tæng hîp ho¸ häc ®· cã vai trß rÊt lín trong viÖc kh¾c phôc nh÷ng bÊt lîi cña c¸c lo¹i vaccine cæ ®iÓn, nh­ng cho ®Õn nay sè vaccine t¸i tæ hîp ®­îc s¶n xuÊt vµ ®­a ra thÞ tr­êng kh«ng nhiÒu. §èi víi mét sè lo¹i vaccine do cÊu tróc cña ph©n tö kh¸ng nguyªn nªn viÖc biÓu hiÖn chóng ë ®èi t­îng vi sinh vËt gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n nh­ vaccine d¹i, vaccine viªm n·o NhËt B¶n. VÊn ®Ò ®Æt ra ë ®©y lµ ph¶i t×m ra ®­îc mét hÖ thèng biÓu hiÖn ®Çy ®ñ ph©n tö kh¸ng nguyªn cña virus. Trªn thÕ giíi, nhiÒu nhµ khoa häc ®ang tËp trung nguyªn cøu s¶n xuÊt vaccine trªn c¸c ®èi t­îng c©y trång nh­: c©y thuèc l¸, c©y l¹c, khoai lang, cµ chua, chuèi… h­íng nghiªn cøu nµy tá ra rÊt cã triÓn väng. Bëi v×, vaccine ®­îc s¶n xuÊt theo c¸ch nµy kh«ng nh÷ng ®· kh¾c phôc ®­îc nh÷ng nh­îc ®iÓm cña c¸c vaccine cæ ®iÓn mµ cßn lµm gi¶m ®¸ng kÓ gi¸ thµnh s¶n phÈm so víi vaccine ®­îc s¶n xuÊt trªn tÕ bµo ®éng vËt, vaccine thùc vËt cã thÓ ®­îc s¶n xuÊt mét l­îng lín víi kü thuËt ®¬n gi¶n phï hîp víi tr×nh ®é cña c¸c n­íc nghÌo. Bªn c¹nh ®ã vaccine thùc vËt cßn cã gi¸ trÞ sö dông vµ b¶o qu¶n, v× nã lµ lo¹i vaccine ¨n ®­îc hoÆc uèng ®­îc (edible vaccine, oral vaccine) [26]. 1.2. BÖnh d¹i ( Rabies disease) Virus d¹i thuéc hä Rhabdoviridae, chi Lysavirrus lµ lo¹i virus h­íng thÇn kinh g©y bÖnh rÊt nÆng cho c¸c loµi ®éng vËt m¸u nãng v× tÕ bµo thÇn kinh kh«ng thÓ t¸i sinh ®­îc, h¬n n÷a khi virus nh©n lªn sÏ lµm mÊt tÝnh g©y ®éc cña tÕ bµo [10]. Virus cã h×nh viªn ®¹n, träng l­îng ph©n tö 3,5 - 4,6 x 106mol wt víi chiÒu dµi kho¶ng 180nm, ®­êng kÝnh 75nm, chøa genome lµ ARN sîi ®¬n ©m (-). Virus nh©n lªn trong tÕ bµo chÊt vµ n¶y chåi tõ mµng sinh chÊt [16]. BÖnh d¹i ®­îc truyÒn cho ng­êi th«ng qua c¸c vÕt c¾n cña c¸c loµi vËt trung gian. C¸c loµi thó ¨n thÞt hoang d· vµ sóc vËt nu«i trong nhµ (chã, c¸o, chã sãi, chån, mÌo, d¬i…) ®Òu cã thÓ lµ æ chøa virus d¹i. ë trung Mü vµ Nam Mü cã nh÷ng ®µn d¬i hót m¸u, d¬i ¨n qu¶ vµ d¬i ¨n c«n trïng còng bÞ nhiÔm virus d¹i. Cßn ®èi víi n­íc ta, nguån truyÒn virus d¹i cho ng­êi chñ yÕu lµ chã, mÌo nu«i trong nhµ (kho¶ng gÇn 97%) [11]. BÖnh d¹i x¶y ra hÇu hÕt c¸c n­íc trªn thÕ giíi lo¹i trõ mét sè hßn ®¶o vïng Caribª, n­íc Anh, Ireland, NhËt B¶n, §µi Loan, T©y Ban Nha vµ Bå §µo Nha. ë vïng T©y ¢u, Cana®a, US, vµ mét vµi n­íc ch©u Mü Latin bÖnh d¹i ®· ®­îc phßng trõ ®èi víi c¸c vËt nu«i trong nhµ, tuy nhiªn virus d¹i vÉn cßn tån t¹i ë trong nh÷ng loµi ®éng vËt hoang d· [32]. Khi ng­êi bÞ con vËt nhiÔm d¹i c¾n, virus tõ n­íc bät cña con vËt sÏ x©m nhËp trùc tiÕp vµo hÖ thèng thÇn kinh ngo¹i biªn vµ tÊn c«ng vµo hÖ thèng thÇn kinh trung ­¬ng hoÆc chóng còng cã thÓ nh©n lªn trong tÕ bµo c¬. Thêi gian ñ bÖnh trong 2 - 8 tuÇn lÔ (cã thÓ chØ kho¶ng 10 ngµy nh­ng còng cã thÓ kÐo dµi mét n¨m, thËm chÝ l©u h¬n). Thêi gian ñ bÖnh tuú thuéc vµo vÞ trÝ vÕt c¾n vµ sè l­îng virus x©m nhËp vµo c¬ thÓ qua vÕt c¾n. NÕu vÕt c¾n gÇn ®Çu vµ cæ th× thêi gian ñ bÖnh sÏ rÊt ng¾n. C¬n d¹i b¾t ®Çu víi c¶m gi¸c sî h·i, ®au ®Çu, sèt, khã chÞu vµ c¶m gi¸c dÞ th­êng liªn quan ®Õn vÕt th­¬ng do sóc vËt c¾n. Mçi khi nh×n thÊy n­íc hoÆc uèng n­íc, c¬ nuèt co th¾t lµm cho bÖnh nh©n sî h·i. Sau ®ã bÖnh tiÕn triÓn ®Õn liÖt, co c¬n ®iªn cuång hoÆc co giËt. BÖnh th­êng kÐo dµi tõ 2 ®Õn 6 ngµy, ®«i khi l©u h¬n. N¹n nh©n chÕt do liÖt c¬ h« hÊp. TÊt c¶ nh÷ng bÖnh nh©n khi ®· lªn c¬n d¹i ®Òu dÉn ®Õn tö vong [6]. ViÖt Nam, tr­íc 1999, mçi n¨m cã hµng triÖu ng­êi bÞ chã d¹i c¾n ph¶i tiªm phßng d¹i, 400 - 500 ng­êi chÕt do bÖnh nµy: trong ®ã 30% lµ c¸c ch¸u nhá d­íi 14 tuæi. ­íc tÝnh mçi n¨m, ViÖt Nam ph¶i tèn tíi vµi chôc tû ®ång ®Ó mua vaccine cho ng­êi vµ chã mÌo. HiÖn nay, sè l­îng tö vong do bÖnh d¹i ®· gi¶m 65%. Tuy nhiªn, hµng n¨m vÉn cã 50 - 60 tr­êng hîp tö vong do bÖnh d¹i vµ h¬n 650.000 ng­êi bÞ sóc vËt c¾n ph¶i ®i tiªm phßng. BÖnh d¹i x¶y ra vµo tÊt c¶ c¸c mïa trong n¨m, nhÊt lµ vµo mïa hÌ, t×nh h×nh dÞch bÖnh cµng t¨ng cao. HÇu hÕt c¸c ®Þa ph­¬ng trªn c¶ n­íc ®Òu cã ng­êi vµ sóc vËt m¾c bÖnh d¹i, trong ®ã ®ång b»ng s«ng Hång vµ trung du B¾c Bé phæ biÕn h¬n c¶ [11]. GÇn ®©y, nguy c¬ nµy cµng t¨ng cao khi bÖnh d¹i diÔn ra phøc t¹p ë nhiÒu n­íc l¸ng giÒng. Tõ n¨m 2001 ®Õn nay sè ng­êi tö vong do bÖnh d¹i t¹i Trung Quèc liªn tôc t¨ng tõ 850 ng­êi lªn tíi 1.300 ng­êi nguyªn nh©n lµ sè chã c¶nh vµ sè chã hoang d¹i gia t¨ng, tû lÖ ®­îc tiªm phßng thÊp. Hµn Quèc ®· ®­îc c«ng nhËn lµ thanh to¸n ®­îc hoµn toµn bÖnh d¹i nh­ng trong n¨m 2003 l¹i cã 2 ng­êi chÕt v× bÖnh d¹i. ViÖt Nam cã quan hÖ mua b¸n sóc vËt víi c¸c n­íc kÓ trªn l¹i cã khÝ hËu nãng Èm nªn rÊt rÔ ph¸t triÓn bÖnh d¹i [11]. 1.2.1. Gen m· ho¸ cho kh¸ng nguyªn glycoprotein cña virus d¹i Virus d¹i thuéc hä Rhabdoviridae, chóng lµ nh÷ng virus ARN, sîi ®¬n ©m (-). ChÝnh v× thÕ, d¹ng ARN anti-sense cña nã mang th«ng tin cÇn thiÕt ®Ó m· ho¸ cho nh÷ng protein virus. §iÒu nµy cã nghÜa r»ng, sîi ARN cña h¹t virus kh«ng trùc tiÕp tham gia vµo qu¸ tr×nh tæng hîp protein mµ chóng ®­îc sao thµnh sîi d­¬ng cã vai trß lµ ARN th«ng tin. §Ó lµm ®­îc ®iÒu nµy, khi x©m nhËp vµo tÕ bµo vËt chñ, virus ph¶i mang theo mét enzym ARN polymerase phô thuéc ARN (enzym tæng hîp sîi ARN bæ sung tõ sîi khu«n ARN) [30]. Gièng nh­ tªn gäi cña chóng, nh÷ng virus nµy cã d¹ng h×nh que, cã mét ®Çu trßn th­êng ®­îc vÝ víi h×nh viªn ®¹n. Líp mµng ngoµi cã nguån gèc tõ mµng tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo vËt chñ do chóng nh©n lªn trong tÕ bµo chÊt vµ xuÊt bµo b»ng c¸ch n¶y chåi ra tõ mµng sinh chÊt [10]. Mét h¹t virus bao gåm mét lâi nucleocapsid lµ ribonucleoprotein cã vai trß quyÕt ®Þnh ®Õn tÝnh l©y nhiÔm cña virus. §ã lµ mét cÊu tróc chuçi xo¾n n»m bªn trong líp mµng cña virus. Chuçi ARN cña virus dµi 12 Kb, m· ho¸ cho 5 lo¹i protein ®ã lµ [33]. - Protein G (Glycoprotein): lµ nh÷ng glycoprotein cã träng l­îng ph©n tö 67kDa tån t¹i d­íi d¹ng trime ®­îc m· ho¸ bëi ®o¹n gen dµi 1675bp. Glycoprotein t¹o thµnh chåi gai bÒ mÆt dµi kho¶ng 5 - 10nm, mang tÝnh kh¸ng nguyªn kÝch thÝch c¬ thÓ s¶n xuÊt ra kh¸ng thÓ trung hoµ h¹t virus. - Protein M (matrix): ®©y lµ mét protein mµng ngo¹i vi cã träng l­îng ph©n tö 26kDa. VÒ chøc n¨ng cña chóng vÉn ®ang cßn lµ vÊn ®Ò g©y tranh c·i, còng cã thÓ nã ho¹t ®éng víi vai trß lµ cÇu nèi gi÷a nucleocapsid víi mµng tÕ bµo hoÆc líp gai glycoprotein bÒ mÆt. - Protein N (nucleoprotein) lµ cÊu tróc bao quanh ARN genome virus cã träng l­îng lµ 55kDa. T¸c dông cña protein nµy lµ b¶o vÖ genome tr¸nh ®­îc sù ph©n c¾t cña nucleases vµ gi÷ cho nã cã h×nh d¹ng thÝch øng trong qu¸ tr×nh dÞch m·. - Protein L (lagre) vµ NS (mét lo¹i protein phi cÊu tróc, nã còng ®­îc biÕt ®Õn nh­ phosphoprotein cã khèi l­îng ph©n tö 38 kDa) hai protein nµy cïng nhau t¹o nªn d¹ng ARN polymerase phô thuéc ARN. Protein L cã khèi l­îng ph©n tö 110kDa vµ ®o¹n gen m· ho¸ cho nã chiÕm kho¶ng 60% (6475bp) chiÒu dµi cña hÖ gen [33]. Nhê øng dông nh÷ng tiÕn bé míi trong kü thuËt di truyÒn, ®Æc biÖt lµ kü thuËt ADN t¸i tæ hîp, chóng t«i ®ang tiÕn hµnh thiÕt kÕ vect¬ t¸i tæ hîp mang gen m· ho¸ cho ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i ®Ó chuyÓn vµo thùc vËt vµ thùc vËt c¶i biÕn di truyÒn nµy sÏ s¶n xuÊt ra vaccine d¹i. 1.2.2. Ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i vµ c¬ chÕ g©y miÔn dÞch . Ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i t¹o thµnh mét líp gai bÒ mÆt c¾m s©u vµo mµng cña virus, cã khèi l­îng lµ 65kDa, th­êng tån t¹i ë d¹ng cÊu tróc trime, lµ mét protein vËn chuyÓn mµng (transmembrane). Mét h¹t virus cã kho¶ng 1200 protein G t¹o thµnh 400 trime, gi÷ vai trß nh­ mét kh¸ng nguyªn khi liªn kÕt víi tÕ bµo ®Ých ®ång thêi cã t¸c dông dung hîp virus víi mµng tÕ bµo vËt chñ khi x¶y ra qu¸ tr×nh nhËp bµo [34]. Qu¸ tr×nh x©m nhËp cña virus x¶y ra theo con ®­êng nhËp bµo bëi v× ph©n tö d¹ng trime cã thÓ chÞu ®­îc pH 6,1. ë pH nµy cÊu tróc trime cña ph©n tö rÊt bÒn v÷ng vµ cã thÓ cho phÐp mét vïng kÞ n­íc trªn ph©n tö ®­îc béc lé vµ g¾n vµo mµng cña tÕ bµo vËt chñ khi x©m nhËp [18]. Virus d¹i còng nh­ c¸c lo¹i kh¸c thuéc chi lysavirus lµ mét lo¹i virus h­íng thÇn kinh g©y ra bÖnh viªm thÇn kinh cÊp tÝnh ë nhiÒu loµi ®éng vËt cã vó. Virus bÒn v÷ng ë tõ pH 3 ®Õn pH 11, vµ cã thÓ sèng nhiÒu n¨m ë -70oC hoÆc ®­îc ®«ng kh« vµ gi÷ ë 0 - 4oC. Nh­ng nã còng bÞ bÊt ho¹t nhanh chãng khi bÞ sÊy kh«, d­íi t¸c dông cña tia UV, tia X, ¸nh s¸ng mÆt trêi, trypsin, (-proplolactone, hoÆc c¸c chÊt tÈy röa kh¸c [10]. Ph©n tö glycoprotein liªn kÕt víi thô thÓ ®Æc hiÖu sÏ g©y ®¸p øng miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo cã sù tham gia cña nh÷ng tÕ bµo T vµ T- bæ trî. Khi ®­îc kÝch thÝch, tÕ bµo T sÏ tiÕt ra lymphokin ho¹t ho¸ c¸c ®¹i thùc bµo, nh÷ng ®¹i thùc bµo nµy sÏ tíi vµ diÖt virus. Cßn tÕ bµo T- bæ trî, chóng sÏ kÝch thÝch tÕ bµo B s¶n xuÊt ra kh¸ng thÓ trung hoµ virus [9]. Liªn kÕt ®Æc hiÖu cña ph©n tö glycoprotein víi c¸c ph©n tö trªn bÒ mÆt tÕ bµo thÇn kinh lµ mét minh chøng, kh¼ng ®Þnh sù tån t¹i cña thô thÓ tÕ bµo thÇn kinh ®Æc hiÖu cho ph©n tö glycoprotein. Trong mét nghiªn cøu gÇn ®©y, ng­êi ta sö dông glycoprotein d¹ng hoµ tan ®Ó kiÓm tra trªn ng©n hµng tÕ bµo thÇn kinh ph«i, vµ ®· chØ ra ®­îc sù tån t¹i cña thô thÓ nuerotrophin p75 murine víi vai trß lµ mét thô thÓ cña glycoprotein. Thô thÓ p75 nuerotrophin tån t¹i bÒn v÷ng trong ®éng vËt cã x­¬ng sèng vµ viÖc biÓu hiÖn cña nã tuú thuéc vµo sù ph¸t triÓn cña bÖnh. Trong qu¸ tr×nh ph¸t sinh ph«i, p75 tån t¹i ë c¶ tÕ bµo n¬ron thÇn kinh vµ tÕ bµo kh¸c, nh­ng ®Õn tuæi tr­ëng thµnh nã chØ ®­îc biÓu hiÖn ë tÕ bµo thÇn kinh ngo¹i vi vµ tÕ bµo thÇn kinh trung ­¬ng. p75 cã chøa 4 miÒn giµu sistein (CRD) ë ®Çu N, ®©y lµ ®Æc ®iÓm ®Æc tr­ng cña liªn hä thô thÓ TNF. Nh­ng kh¸c víi cÊu tróc trime cña hä TNF, hä NGF cña ligand neurotrophin l¹i cã cÊu tróc dime. ¸i lùc liªn kÕt víi p75 dao ®éng trong kho¶ng vµi nanogram, vÞ trÝ liªn kÕt ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ mét vïng bao gåm c¶ CRD2 vµ CRD3. Vai trß sinh lý häc cña liªn kÕt nµy trong c¸c n¬ron thÇn kinh ngµy nay vÉn cßn ®ang lµ mét vÊn ®Ò tranh c·i. Mét vµi h­íng nghiªn cøu míi ®©y kh¸m ph¸ ra r»ng, tiÒn neurotrophin còng cã ¸i lùc cao víi p75 [25]. 1.3. Vi khuÈn agrobacterium timefaciens vµ hiÖn t­îng biÕn n¹p gen vµo thùc vËt. Trong tù nhiªn chóng ta th­êng gÆp ë vïng cæ rÔ c¸c loµi thùc vËt hai l¸ mÇm mét lo¹i khèi u gåm c¸c lo¹i tÕ bµo kh«ng ph©n ho¸ vµ ph¸t triÓn kh«ng cã tæ chøc. Nh÷ng khèi u nµy mÊt kh¶ n¨ng ph©n cùc vµ ph©n chia liªn tôc gièng nh­ tÕ bµo ung th­ ¸c tÝnh ë ®éng vËt. Theo c¬ chÕ h×nh thµnh ng­êi ta ph©n biÖt hai lo¹i khèi u chÝnh. §ã lµ khèi u di truyÒn vµ khèi u c¶m øng. Khèi u di truyÒn th­êng xuÊt hiÖn ë mét vµi cÆp lai cã tÝnh chÊt hoµ hîp kh«ng cao ë mét nhiÔm s¾c thÓ riªng rÏ nµo ®ã, ®Æc biÖt khi lai c¸c loµi kh¸c chi cña thuèc lµ Nicotiana hoÆc chi rau c¶i Brasica. Lo¹i khèi u c¶m øng ®­îc biÕt ®Õn nhiÒu nhÊt lµ khèi u crown gall do lo¹i vi khuÈn ®Êt a. tumefaciens g©y nªn. C¬ chÕ chÝnh h×nh thµnh khèi u c¶m øng nµy ®­îc Braun vµ Schiperoort nghiªn cøu kü n¨m 1960 vµ ®­a l¹i nh÷ng thµnh tùu quan träng cho viÖc ph¸t triÓn kü thuËt di tru