Đề tài Tính chất động học của phản ứng enzyme

Nguyễn Xuân Hưng 2005 1 MỤC LỤC Mục lục 1 Mở đầu 2 Giới thiệu chung 3 1.1 Lịch sử phát triển 3 1.2 Enzyme dị không gian 4 Động học enzyme dị thể 6 2.1 Mô hình thứ tự 6 2.1.1 Enzyme dimer 7 2.1.2 Enzyme tetramer 8 2.1.3 Trường hợp tổng quát 11 2.2 Mô hình đối xứng hay phối hợp 13 2.2.1 Khi không có chất hiệu ứng 18 2.2.2 Các chất hiệu ứng gắn riêng 19 2.2.3 Cơ chất và chất hiệu ứng gắn chung (nonexclusive) 23 Tài liệu tham khảo 27 Nguyễn Xuân Hưng 2005 3 1. Giới thiệu chung 1.1 Lịch sử phát triển Năm 1913, Leonon Michaelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình để giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzyme. Phương trình Michaelis - Menten đúng trong nhiều trường hợp đơn giản cũng như phức tạp. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, vận tốc xúc tác cực đại khi enzyme bão hoà cơ chất, ký hiệu là Kcat, còn phụ thuộc vào một số hằng số vận tốc khác [Lê Ngọc Tú et al., 2002]. Vào giữa những năm 1950, một số nhà nghiên cứu đã mô tả các enzyme có tính chất xúc tác không chỉ phụ thuộc cơ chất mà còn phụ thuộc vào các phân tử hiệu ứng. Các nghiên cứu con đường điều hoà sinh tổng hợp ở vi khuẩn cho thấy rằng tính chất xúc tác của enzyme đầu tiên thường được điều biến bởi sản phẩm cuối cùng của con đường. Sản phẩm cuối cùng này có cấu trúc khác với cơ chất. Các cơ chế điều hoà theo kiểu này đóng vai trò sống còn trong trao đổi chất. A B C D E F [Theo Talaro, 2002] Trong sơ đồ trên, F là sản phẩm cuối cùng thiết yếu (axit amin hoặc nucleotide) kìm hãm enzyme 1 (enz1), bước đầu tiên trong con đường. Do đó, khi F được tạo ra đủ, nó tự khoá sự tổng hợp của chính mình. Hiện tượng này gọi là kìm hãm hồi biến hay điều hoà ngược [Garrett & Grisham, 2003]. Một trong các ví dụ đầu tiên của hiện tượng này xuất phát từ nghiên cứu threonine deaminase của vi khuẩn E. coli. Abelson (1954) thấy rằng nếu thêm isoleucine vào canh trường vi khuẩn sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp tiếp theo của chính nó. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy hiệu ứng này do threonine deaminase, enzyme đầu tiên trong lộ trình sinh tổng hợp của isoleucine bị kìm hãm đặc biệt bởi isoleucine [Umbarger, 1956]. Các enz1 enz2 enz3 enz4 enz5 Nguyễn Xuân Hưng 2005 4 nghiên cứu sâu hơn với threonine deaminase tinh khiết cho thấy cơ chất threonine và chất kìm hãm isoleucine gắn với enzyme tại các vị trí khác nhau [Copeland, 2000]. Một ví dụ nữa là sự kìm hãm CTP của aspartate carbamoyltransferase [Yates & Pardee, 1956]. Enzyme này xúc tác tạo thành carbamoylaspartate từ aspartate và carbamoylphosphate, bước đầu tiên trong sinh tổng hợp de novo pyrimidine. Đồ thị tốc độ phản ứng - cơ chất aspartate có hình sigmoid, chứng minh tính hợp tác giữa các trung tâm hoạt động của enzyme oligomer này [Copeland, 2000]. Ví dụ đầu tiên được xác định rõ ràng là nghiên cứu của Cori và đồng sự cho thấy 5’- AMP cần cho hoạt tính xúc tác in vitro của glycogen phosphorylase b của cơ xương trong trạng thái nghỉ (resting skeletal muscle) [Fischer et al., 1971]. Để hiểu đầy đủ cơ chế điều hoà sinh học quan trọng này cần một khuôn khổ lý thuyết để mô tả làm thế nào mà các vị trí khác nhau trong enzyme có thể tương tác để tác động đến ái lực của các vị trí khác bởi các phối tử giống hoặc khác cơ chất [Copeland, 2000]. 1.2 Enzyme dị không gian Định nghĩa dị không gian (Allosteric, theo tiếng Lain allos có nghĩa là khác, stereos có nghĩa là cấu trúc) được Monod và cộng sự đưa ra vào đầu những năm 1960 để nhấn mạnh tương tác hợp tác của những vị trí khác nhau dẫn tới biến đổi cấu trúc của protein. Các khác nhau trong cấu trúc cơ chất và chất hiệu ứng được chú ý đầu tiên bởi Monod và Jacob. Họ đã đưa ra trong buổi thuyết trình năm 1961 rằng chất hiệu ứng gắn với các vị trí khác nhau và tách biệt [Monod & Jacob, 1961]. Chúng được gọi là vị trí dị không gian để phân biệt với trung tâm hoạt động. Hai ông cũng kết luận rằng các chất hiệu ứng gián tiếp gây ra biến đổi hình dạng của enzyme do đó thay đổi vị trí xúc tác và các tính chất động học của nó [Marangoni, 2003]. Các enzyme nêu trên là đối tượng của điều hoà ngược, đại diện cho nhóm enzyme có tên enzyme điều hoà (regulatory enzyme). Năm 1963, Monod và đồng sự biên soạn dữ liệu về các enzyme điều hoà [Monod et al., 1963] và nhận thấy chúng có các tính chất đặc biệt [Garrett & Grisham, 2003]: 1. Động học của các enzyme điều hoà không tuân theo phương trình Michaelis-Menten. Đồ thị v - [S] của chúng là đường cong dạng sigmoid hay S (hình 1). Các đường cong này chỉ ra tương quan bậc hai (hoặc cao hơn) giữa v và [S]; trong đó v tỷ lệ với [S]n (n > 1). 2. Sự kìm hãm của enzyme điều hoà bởi chất kìm hãm ngược (F) không giống với bất kỳ mô hình kìm hãm thông thường nào. F có cấu trúc ít tương đồng với cơ chất của enzyme điều hoà (S). F rõ ràng gắn với vị trí không phải trung tâm hoạt động của enzyme. 3. Các enzyme điều hoà hay enzyme dị không gian như enzyme 1 trong một vài trường hợp được điều hoà tăng bởi chất hoạt hoá. 4. Các enzyme dị không gian có tổ chức oligomer. Chúng gồm nhiều hơn một chuỗi polypeptide (phần dưới đơn vị) và có nhiều hơn một vị trí gắn S. 5. Lý thuyết được chấp nhận là, bằng cách nào đó tương tác của một enzyme điều hoà với chất hiệu ứng hoặc chính cơ chất làm thay đổi hình dạng hoặc trật tự tương tác Nguyễn Xuân Hưng 2005 5 vốn có của các phần dưới đơn vị enzyme. Ngoài enzyme, các protein không có hoạt tính xúc tác cũng thể hiện một số tính chất này, tiêu biểu là hemoglobin. Có hai loại hiệu ứng trong trường hợp của một enzyme điều hoà là hiệu ứng hợp tác và hiệu ứng dị không gian. Tính hợp tác (Cooperativity) Tính hợp tác được quan sát khi phản ứng của một phân tử cơ chất với protein tác động đến hiệu quả phản ứng của cơ chất thứ hai với trung tâm hoạt động khác [Gilbert, 2000]. Nguyên nhân là do khi cơ chất gắn vào enzyme gây ra các biến đổi điện tích và/hoặc cấu trúc dẫn đến thay đổi ái lực gắn cơ chất của các trung tâm hoạt động còn lại [Marangoni, 2003]. Cơ chế dị không gian Đó là khi sự gắn của một phân tử hiệu ứng tại vị trí không phải trung tâm hoạt động của enzyme tác động đến Km hoặc Vmax của enzyme đó [Gilbert, 2000]. Phối tử gắn tại một vị trí phải làm thay đổi cấu trúc xung quanh protein truyền theo chuỗi polypeptide tới trung tâm hoạt động ở xa [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Một chú ý quan trọng và cần luôn nhớ rằng tất cả các phương trình gắn và tốc độ của các enzyme hợp tác và dị không gian thu được dưới các giả định cân bằng nhanh (rapid equilibrium) [Leskovac, 2003]. Hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác thường đi đôi với nhau vì các biến đổi cấu trúc thông thường cần cả hai. Bản chất của cả hai hiệu ứng là các yếu tố gắn (và xúc tác) tại một trung tâm hoạt động có thể ảnh hưởng đến các yếu tố gắn (và xúc tác) tại trung tâm hoạt động khác của protein đa thành phần. Thông thường, vùng điều hoà và trung tâm hoạt động của enzyme dị không gian được tìm thấy tại bề tiếp giáp giữa các phần dưới đơn vị [Gilbert, 2000]. Việc phân biệt giữa hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác nằm trong phân tử gây ra tác động [Gilbert, 2000]. Các đáp ứng đẳng hướng chỉ điều biến dị không gian hoạt tính enzyme gây ra bởi cơ chất, các đáp ứng dị hướng chỉ điều biến dị không gian hoạt tính enzyme bởi các phân tử phi cơ chất hoặc kết hợp của các phân tử cơ chất và phi cơ chất. Điều biến dị không gian có thể là dương (hoạt hoá) hay âm (kìm hãm). Một số enzyme dị không gian cũng thể hiện tính điều hoà làm việc phân biệt rõ ràng giữa hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác đôi khi rất khó [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Tuy nhiên, gần đây người ta khám phá ra một số protein có tính chất dị không gian nhưng lại có cấu trúc monomer. Gunasekaran và cộng sự (2004) đã đưa ra kết luận rằng dường như dị không gian là tính chất nội tại của tất cả các protein [Gunasekaran et al., 2004]. Nguyễn Xuân Hưng 2005 6 2. Động học enzyme dị thể Trong trường hợp enzyme oligomer, thông thường các phần dưới đơn vị giống nhau hoàn toàn. Mỗi phần dưới đơn vị có một trung tâm hoạt động để gắn phối tử. Nếu các vị trí này đồng nhất và độc lập với nhau (có cùng Km và kcat với cơ chất), sự có mặt của cơ chất tại một vị trí sẽ không ảnh hưởng đến tính chất xúc tác và khả năng gắn cơ chất của vị trí khác [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Động học của n enzyme một vị trí gắn phối tử giống với động học của một enzyme có n trung tâm hoạt động trong trường hợp này [Segel, 1975]. Do đó, phương trình tốc độ của enzyme oligomer với n trung tâm hoạt động độc lập không tương tác là: ]S[ ]S[ Smax + = kV v Với Vmax = kcat[ET]; ks là hằng số phân ly vi mô (disasosiation microscopic constant) của phức hệ ESn [Marangoni, 2003]. ◄Hình 1: Đường cong vận tốc đầu - nồng độ cơ chất của enzyme điều hoà. Đường cong này có hình sigmoid khác với trường hợp theo mô hình Michaelis-Menten [Theo Marangoni, 2003]. Hoạt tính enzyme cũng bị ảnh hưởng bởi sự gắn của cơ chất và các phối tử không phải cơ chất (chất kìm hãm hoặc hoạt hoá) tại vị trí khác trung tâm hoạt động. Đây là trường hợp của các enzyme dị không gian. Trong trường hợp này, đường cong v - [S] có hình sigmoid gần giống chữ S (hình 1). Hai mô hình lý thuyết được đưa ra để giải thích tính dị không gian của các enzyme oligomer tương tác hợp tác là mô hình tương tác thứ tự và mô hình đối xứng hay mô hình chuyển tiếp phối hợp (concerted transition). 2.1 Mô hình thứ tự Năm 1966, Koshland, Nemethy và Filmer đã trình bày một số mô hình cho các protein hoặc các enzyme oligomer [Koshland et al., 1966]. Giả thiết cơ bản của mô hình tương tác thứ tự (SI) là hình dạng enzyme bị biến đổi đáng kể khi cơ chất gắn vào, làm thay đổi ái lực gắn cơ chất của các trung tâm hoạt động còn lại (hình 2). Trong trường hợp điều hoà dương, mỗi phân tử cơ chất gắn vào làm phân tử cơ chất tiếp theo dễ gắn với trung tâm hoạt động còn lại hơn. Do đó đường cong v - [S] có độ dốc tăng rõ rệt khi nồng độ cơ chất tăng. Khi trung tâm hoạt động đã bão hoà, độ dốc của đường cong giảm dần [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. (1) Nguyễn Xuân Hưng 2005 7 2.1.1 Enzyme dimer Trường hợp đơn giản nhất là enzyme dimer dị không gian có tính hợp tác dương. Các cân bằng gắn cơ chất và hằng số cân bằng của chúng được minh hoạ trong hình 2 [Segel, 1975]. Koshland cho rằng protein là các phân tử linh động, hình dạng của chúng thay đổi khi gắn với phối tử. Do vậy, khi enzyme oligomer gắn với một phối tử sẽ gây ra chuyển tiếp hình dạng của chính nó để dễ hoặc khó gắn hơn với các phối tử khác (cùng hoặc khác loại). Hình 3 thể hiện các đặc trưng quan trọng của mô hình này với enzyme dimer. Chú ý rằng trong trường hợp này không cần duy trì tính đối xứng, hai phần đưới đơn vị có thể có hình dạng khác nhau. Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, sau khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác có ái lực thấp hoặc cao hơn với S (hoặc một số phối tử khác). Cơ chế được đưa ra là biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử của một phần dưới đơn vị có thể chuyển tiếp hiệu ứng của nó tới các phần dưới đơn vị bên cạnh bằng những tương tác thay thế và các sắp xếp của các gốc axit amin tại nơi tiếp giáp của các dưới đơn vị. Phụ thuộc vào ái lực tương đối của hình dạng thích ứng với dưới đơn vị bên cạnh, hiệu quả tổng thể của phối tử gắn tiếp theo có thể là âm, dương hoặc trung tính (hình 3) [Garrett & Grisham, 2003]. ►Hình 3: Mô hình SI với enzyme dị không gian. (a) Cơ chất S gắn vào làm biến đổi hình dạng của dưới đơn vị mà nó gắn. (b) Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác biến đổi hình dạng để có ái lực lớn hơn (đẳng hướng dương) hoặc nhỏ hơn (đẳng hướng âm) với S. Nói cách khác, biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử trong một dưới đơn vị có thể ảnh hưởng đến dưới đơn vị kề bên. Các hiệu ứng này có thể được chuyển tiếp giữa các miền peptide cạnh nhau bằng cách thay đổi sự sắp xếp của các gốc axit amin không liên kết [Theo Garrett & Grisham, 2003]. ◄Hình 2: Sơ đồ cân bằng khi enzyme holodimer gắn với cơ chất, ở đó cơ chất gắn được trợ giúp bởi sự chuyển vị hình dạng của phần dưới đơn vị nơi nó gắn, theo mô hình Koshland và cộng sự (1966) [Theo Copeland, 2000]. S S S S KS KS aKS aKS +S +S +S +S Nguyễn Xuân Hưng 2005 8 Hằng số kết hợp của cơ chất đầu tiên là KS. Tuy nhiên, khi một trong các vị trí gắn cơ chất bị chiếm giữ, hằng số phân ly của vị trí thứ hai bị biến đổi a lần (với tính hợp tác dương, a < 1). Phương trình vận tốc tổng thể của enzyme này là [Copeland, 2000]: 2 S 2 S 2 S 2 S max ]S[]S[21 ]S[]S[ aKK aKK V v ++ ÷÷ ø ö çç è æ + = 2.1.2 Enzyme tetramer Mở rộng mô hình với enzyme tetramer (hình 4). Trong trường hợp này phân tử cơ chất đầu tiên gắn vào làm biến đổi hằng số phân ly của toàn bộ ba vị trí gắn khác a lần. Nếu phân tử cơ chất thứ hai tiếp tục gắn vào, hai vị trí gắn còn trống sẽ có hằng số phân ly biến đổi tiếp b lần trở thành abKS. Tương tự, khi trung tâm hoạt động thứ ba bị cơ chất chiếm giữ, vị trí còn lại sẽ bị biến đổi tiếp c lần và hằng số phân ly sẽ là abcKS [Copeland, 2000]. ▲Hình 4: Sơ đồ tương tác thứ tự của cơ chất với enzyme điều hoà bốn phần dưới đơn vị. Một phân tử cơ chất gắn với trung tâm hoạt động sẽ làm thay đổi ái lực của các vị trí khác. ki là hằng số phân ly vi mô của các vị trí thứ i tương ứng [Theo Marangoni, 2003]. Đường cong v - [S] có hình sigmoid (hình 1). Theo lý thuyết, enzyme điều hoà tetramer có bốn trung tâm hoạt động, phương trình tốc độ phản ứng và cân bằng khối của enzyme là [Marangoni, 2003]: ]ES[4]ES[3]ES[2]ES[ 4cat3cat2cat1cat kkkkv +++= ]ES[]ES[]ES[]ES[E][]E[ 4321 ++++=T Thừa số yếu tố tương tác Để thuận tiên, khi nghiên cứu enzyme điều hoà người ta cố gắng quy tất cả các hằng số phân ly khi có cơ chất gắn vào (k1, k2, k3, k4) về hằng số phân ly vi mô nội tại k. Hằng số phân ly nội tại của phức ES là k1, trong trường hợp này k1 = k. Khi cơ chất gắn với trung tâm hoạt động đầu tiên, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ hai (ES2) sẽ biến đổi a lần: k2 = ak Khi cơ chất thứ hai gắn, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ ba sẽ biến đổi b lần: k3 = abk (2) (3) (4) (5) (6) S S S S S S S S S S k1 k3 k4 k4 Nguyễn Xuân Hưng 2005 9 Khi phân tử cơ chất thứ ba gắn vào, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ tư sẽ biến đổi c lần: k4 = abck a, b, c được gọi là các thừa số yếu tố tương tác. Do đó, với enzyme điều hoà tetramer, hằng số phân ly nội tại enzyme - cơ chất tổng thể (k’): k’ = k1k2k3k4 = a3b2ck4 Các thừa số tương tác sẽ có giá trị 1 với điều hoà âm. Rất khó thu được các thừa số tương tác riêng biệt, hoặc các hằng số phân ly nội tại chính xác bằng cách phân tích động học enzyme trong trạng thái hoạt tính ổn định [Marangoni, 2003]. Hằng số phân ly vi mô - vĩ mô Việc phân biệt các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô là điều quan trọng. Số cách các phân tử cơ chất chiếm giữ n trung tâm hoạt động trong enzyme, không quan tâm đến sự thay thế và thứ tự chiếm giữ (tổ hợp C) là [Marangoni, 2003]: !)!( ! ssn nC - = Với s là số phân tử cơ chất gắn với enzyme. Trong trường hợp enzyme tetramer có 4 trung tâm hoạt động (n = 4). Số cách tạo phức hệ enzyme-cơ chất vi mô ES2 là 6 (hình 5). Nồng độ của mỗi loại ES2 vi mô sẽ là [ES2]/6. Mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô đạt được bằng cách thay các điều kiện nồng độ ESn vĩ mô bằng điều kiện nồng độ ESn vi mô, giả định cân bằng có thể xảy ra cho mỗi loại vi mô. Ví dụ, hằng số phân ly vĩ mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 S =K Như được đề cập ở trên, có 6 cách enzyme và cơ chất tạo thành các loại ES2 vi mô. Với phức ES và ES3, có thể tạo thành bốn loại vi mô khác nhau trong khi chỉ có một loại vi mô cho phức hệ ES4 (hình 5). Do đó nồng độ ES2 vi mô là [ES2]/6. Nồng độ của phức hệ ES, ES3, và ES4 vi mô tương ứng là [ES]/4, [ES3]/4, và ES4 [Marangoni, 2003]. Từ những điều trên, hằng số phân ly vi mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 4/]ES[ S])[6/]ES([ 3 2 3 2 ==Sk Do đó, mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vĩ mô (Ks ) và vi mô (ks ) của phản ứng này là: SS kK 2 3 = (7) (8) (9) (10) (11) (12) Nguyễn Xuân Hưng 2005 10 ▲Hình 5. Các trường hợp trong đó, tương ứng, một, hai, ba và bốn phân tử cơ chất có thể chiếm giữ ngẫu nhiên các vị trí gắn trên một enzyme có bốn vị trí điều hoà [Theo Marangoni, 2003]. Như vậy, hằng số phân ly vĩ mô hay toàn bộ (Kn) và vi mô hay nội tại (kn) với các phức hệ ESn khác nhau là [Marangoni, 2003]: ][ES E][S][ 4 1 1 11 == kK 11 1 E][S][4E][S][]ES[ kK == ][ES ][S]ES[ 3 2 2 1 22 == kK 21 2 21 2 2 E][S][6E][S][]ES[ kkKK == ][ES ][S]ES[ 2 3 3 2 33 == kK 321 3 321 3 3 E][S][4E][S][]ES[ kkkKKK == ][ES ][S]ES[4 4 3 44 == kK 4321 4 4321 4 4 E][S][E][S][]ES[ kkkkKKKK == Khi cơ chất gắn vào, hằng số phân ly có thể giảm trong trường hợp điều hoà dương (tăng ái lực của enzyme với cơ chất) hoặc tăng trong trường hợp điều hoà âm (giảm ái lực của enzyme với cơ chất) [Marangoni, 2003]. S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 1 4 6 4 (13) (14) (15) (16) Nguyễn Xuân Hưng 2005 11 Chuẩn hoá phương trình tốc độ ta có [Marangoni, 2003]: 4321 4 321 3 21 2 1 4321 4 321 3 21 2 1 max /]S[/]S[4/]S[6/]4[S1 /]S[/]S[3/]S[3/]S[ kkkkkkkkkk kkkkkkkkkk V v ++++ +++ = Với Vmax = 4kcat[ET ]. Trong trường hợp đặc biệt, khi enzyme có tính điều hoà dương rõ rệt, [ES], [ES2], và [ES3] << [ES4]. Ta có dạng thu gọn [Marangoni, 2003]: 4 4 4321 4 4321 4 max ]S[' ]S[ /]S[1 /]S[ + = + » kkkkk kkkk V v ; Với k’ = k1k2k3k4= a3b2ck4 2.1.3 Trường hợp tổng quát Tổng quát hoá phương trình 18 với enzyme điều hoà cao có n trung tâm hoạt động: n n kV v ]S[' ]S[ max + = Phương trình 19 gọi là phương trình Hill. Hằng số Hill k’, hệ số Hill n, và Vmax là các tham số được dùng để xác định tính chất xúc tác của các enzyme điều hoà. Hằng số Hill liên quan đến các hằng số phân ly enzyme - cơ chất (k’ = Pkn) cho phép đánh giá ái lực của enzyme với một cơ chất riêng. Tương quan giữa hằng số Hill và nồng độ cơ chất tại ]S[ 2 1 0,5maxV là: nk ]S[' 0,5= Hằng số Hill là một chỉ số của ái lực enzyme với cơ chất, nhưng không phải là hằng số phân ly enzyme - cơ chất. Đơn vị của nó là (nồng độ)n. Do vậy khó mà so sánh các phản ứng có giá trị n khác nhau [Marangoni, 2003]. Hệ số Hill là một chỉ số của tính điều hoà trong quá trình gắn cơ chất. Giá trị n càng lớn, tính điều hoà càng cao. Trong trường hợp n = 1 (không hợp tác), phương trình Hill trở thành phương trình Michaelis - Menten. Khi mức độ hợp tác của các vị trí thấp, n sẽ không còn là số vị trí gắn cơ chất và có thể không phải là số nguyên [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Tuy nhiên, phương trình Hill vẫn có thể được sử dụng để xác định động học của enzyme điều hoà. Trong trường hợp này, hệ số xác định được từ thí nghiệm gọi là giá trị n biểu kiến (nH). Giá trị làm tròn lên của nH gọi là số vị trí gắn cơ chất nhỏ nhất trên enzyme oligomer. Ví dụ, từ thí nghiệm xác định được nH = 1,65. Mặc dù có thể nói rằng số vị trí gắn nhỏ nhất trên enzyme là 2 và các vị trí thể hiện mức độ hợp tác vừa phải. Tuy nhiên, không có bằng chứng thí nghiệm cho thấy enzyme này chỉ có hai vị trí gắn cơ chất. Nó có thể có 3, 4 hoặc nhiều vị trí gắn hơn với tính hợp tác yếu hơn. Điều này giải thích tại sao giá trị 2 trong ví dụ này gọi là số vị trí gắn có thể