Đề tài Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis

LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường. II. Lý do chọn đề tài Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những vi sinh vật khác. Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy sản xuất ở qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế quốc dân. III. Mục đích của đề tài Để tìm hiểu về một số vấn đề như: Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis. Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật. Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis. Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở qui mô công nghiệp. Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”. IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis. Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis. V. Phương pháp nghiên cứu Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi khuẩn Bacillus subtilis. Tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải quyết các mục đích đề ra. Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT 1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào 1.1.1. Định nghĩa Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh, các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.1.2. Phân loại Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác. Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H α-amylase Ví dụ: Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và pectinase… 1.1.3. Đặc điểm - tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do phân tử lượng lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào . Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Kiềm Acid Protein -COOH Protein -COO- + H+ Acid Kiềm Protein -NH2 Protein -NH+ + H+ Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate. Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hóa. Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1… Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+. Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu với cơ chất. Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích thước nhỏ hơn để có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng. Là những enzyme cảm ứng với cơ chất nên quá trình tổng hợp enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ. Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải chú ý hai điểm: Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào môi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào môi trường tinh bột; protease thì bổ sung protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose… Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm. Do đó, không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao. Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra ở ngoài tế bào. Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam. Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Acid Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose Saccharase Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa. Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme. Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng. Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.1. Enzyme amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: Amylase Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH OH – RH + R’OH Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân). Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-amylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. 1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan glucanhydrolase) α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) và acid aspartic (Asp). Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys). Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng 45.000 - 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 - 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein, 1960). α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH3 trong trung tâm hoạt động. α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở ethanol 60%. Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951). Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như α-amylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 còn của enzyme từ Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60 -70oC, nhưng cũng có thể tới 80 - 90oC đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt. α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính của α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca2+ 0,1 nguyên tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số này chỉ giảm 13 lần. Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm rõ rệt. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ trong phân tử (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I -. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ và Sn2+ không ảnh hưởng lắm đến α-amylase. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của α-amylase Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: Giai đoạn dextrin hóa Giai đoạn đường hóa Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen Maltotetrose, maltotriose và maltose Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1). Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase: α-amylase Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide Amylose Oligosacharide Poliglucose Maltose Maltotriose Maltotetrose 1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase) Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C1 của glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi. Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 60.000 Da. Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ưu là 50 - 65oC. β-amylase bị bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70oC. Thường β-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật. β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca+2. Hình 1.3. Cấu trúc không gian của β-amylase Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa, phâ