Đề tài Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCMNhập Môn Công Nghệ Sinh HọcThuyết TrìnhỨng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Sản Xuất Thuốc BVTVGVHD: Ts.Nguyễn Vũ PhongĐặt Vấn ĐềThuốc Trừ Sâu Sinh Học ( Biopesticides )Vi Khuẩn (Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Bacillus papillae )Các virus côn trùng thuộc họ BaculoviridaeCó 2 hướng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong vấn đề tạo giống và sản xuất thuốc trừ sâu sinh học:- Cắt phân lập và tái tổ hợp các gien sản xuất protein kết tinh ( nội độc tố ) của B.thuringiensis và plasmid của E.coli và sản xuất theo phương pháp CNSH.- Sản xuất Baculovirus theo phương pháp nuôi cấy tế bào. Để tăng cường tính gây bệnh của baculovirus, giảm thời gian nung bệnh và gây chết nhanh công trùng, người ta tái tổ hợp gien sản xuất nọc độc của ong, nhện vào virus baculovirus và sản xuất theo lối CNSH.- Các loại vi khuẩn Bacillus thường sinh trưởng, phân chia mạnh và khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng, chúng hình thành bào tử.1.Vi khuẩn Bacillus thuringgiensis làm thuốc trừ sâu sinh học- Bào tử là một dạng quá độ của sự sinh sản, được hình thành trong điều kiện bất lợi của môi trường và có tính kháng với ngoại cảnh khá cao.- Các loại Bacillus trong quá trình hình thành có sản xuất một loại protein nào đó, rất độc đối với các loài VSV khác.Phương Pháp Thực HiệnCó 2 chủng Bacillus thunringiensis đáng quan tâm- Bacillus thurigiensis var.israelensis: loại này gây bệnh cho hầu hết côn trùng hút máu như muổi, ve, bét,được coi là vector truyền bệnh ở người và động vật.- Bacillus thurigiensis var.tenebrionis phát hiện năm 1983, có tác dụng gây bệnh với các loài bọ gây thiệt hại lớn với khoai tâyBacillus thurigiensis var.israelensisBacillus thurigiensis var.tenebrionisTinh thể protein nội bào ( nội độc tố $ ) và gien CryTinh thể proteun có thể là dạng hình bình hành, nhiều góc cạnh hoặc hình khối đa chiều.Tinh thể protein của Bacillus thuringiensis được hình thành trong khi nha bào hóa ( sporulation )Nha bào:một dạng tiềm sinh của các loại vi khuẩn trong họ Bacillus Tinh thể protein được mang trong nha bào là một tiền độc tố ( protoxin )- Tinh thể protein hình bình hành bao gồm 2 loại protein tiền độc tố : một loại có phân tử lượng 135 Kda, 2 loại có phân tử lượng 140 Kda. Tất cả đều đặc hiệu gây độc cho côn trùng trong lớp Lepidoptera.- Tinh thể hình khối chỉ chứa duy nhất một protoxin có phân tử lượng 65 Kda và đặc hiệu gây độc cho cả Lepidoptera vả Diptera.Có 4 nhóm gien Cry sản xuất các loại tinh thể proteinCry-I sản xuất tin thể protein đặc hiệu gây bệnh cho lớp LepidopteraCry-II đặc hiệu cho lớp Lepidotera và DipteraCry-III cho ColeopteraCry-IV cho DipteraChịu trách nhiệm sản xuất nội độc tố delta là gien có tên gọi là Cry. Thực chất gien Cry không nằm trong hệ gien của Bacillus thuringiensis mà là do các loại plasmid của Bacillus thuringiensis cưu mang.- Loại plasmid 67.000 nucleotide chứa gien Cry-I sản xuất loại protoxin 135Kda và loại plasmid này có thể dùng để chuyển nạp qua lại trong các chủng Bacillus thuringiensis .- Loại plasmid 174.000 nucleotide có 2 gien Cry-I và Cry-II, sản xuất protoxin 140 Kda, và 65 Kda. Loại plasmid này chỉ thích ứng riêng cho chủng Bacillus thuringiensis typ HD-1.Khi mem protease trong hệ tiêu hóa của côn trùng phân cắt rời thành các tiểu phần khác nhau.Tiểu phần protein có tính độc với côn trùng chỉ có phân tử lượng 60 – 70 Kda. Đó là phần hoạt tính, các phần khác chỉ có chức năng làm nền và bảo vệ đó là phàn kết tinh.Tái tổ hợp gien Cry - Công nghệ sinh học sản xuất tinh thể protein diệt công trùng.- Chủng Bacillus thuringiensis cung cấp nguồn gien Cry được dùng hiện nay là Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 7, sản xuất 2 protoxin: 130 KDa và 135 KDa . - Khi 2 gien Cry chịu trách nhiệm sản xuất 2 loại protoxin này được tái tổ hợp vào plasmid của E.coli thì trong tế bào E.coli các tinh thể protein của protoxin được sản xuất và thu được gần như nguyên chất.Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 71.Tái Tổ Hợp GenCông nghệ sinh học sản xuất nội độc tố delta của Bacillus thuringiensis sữ dụng kỹ thuật tái tổ hợp gien.Các gien Cry đặc hiệu với nhóm Lepidoptera của Bacillus thuringiensis được cắt và phân lập rồi nối vào plasmid của E.coli+ Gien Cry được lấy từ Bacillus thuringiensis var.berliner chuyễn nạp vào E.coli, cho sản phẩm protoxin ký hiệu Bt2.+ Tái tổ hợp gien Cry từ Bacillus thuringiensis var.aizawai typ HD-68 vào E.coli cho sản phẩm Bt3.2.Chuyển protoxin thành toxin- Protoxin thành phẩm sau khi được xữ lý bằng mem trypxin, sẽ chuyễn thành toxin.- Mem Trypxin giống như các loại mem phân cắt protein có trong ruột côn trùng, đã cắt protoxin cho một tiểu phần khoảng 60Kda có hoạt tính gây độc.- Loại mem trypxin và các thành phần khác, chúng ta thu được độc tố tinh khiết.3. Chuẩn độ độc tốChuẩn độ độc tố ( toxin titration ): tức là tìm liều lượng thích hợp của một loại độc tố để gây nhiễm một loại côn trùng nhất định.Có 2 loại ấu trùng được sữ dụng để chuẩn độ độc tố: Ấu trùng sâu cuốn thuốc lá ( Manduca sexta ) Ấu trùng bướm trắng ( Pieris brassicae ).Ấu trùng sâu cuốn thuốc lá ( Manduca sexta)Ấu trùng bướm trắng ( Pieris brassicae )Độc tố được hòa thành các nồng độ khác nhau, thấm vào thức ăn và cho chúng ăn trong giai đoạn phát triển từ ấu trùng thành nhộng.Sau khi tính toán được lượng độc tố gây chết 50% ấu trùng chuẩn độ, từ đó ta có thông số cần thiết để sữ dụng độc tố chống côn trùng phá hoại mùa màng. Virus côn trùng ( Baculovirus )Baculovirus là tên chung chỉ các loài virus côn trùng có dạng hình que- Đặc tính hình thái của chúng, đc phân loại thuộc họ virus có tên là Baculoviridae - Chiếm trên 60% tổng số gây bệnh cho côn trùng- Chúng hoàn toàn không gây nhiễm và gây bệnh cho người, động vật, kể cả thực vật. Ấu trùng nhiễm baculovirus theo đường thức ănKhi đã vào hệ tiêu hóa, virus xâm nhập vào các tế bào biểu mô và thực hiện chu kỳ nhân lên của mình.Trong các tề bào bị nhiễm, trước hết AND của virus thực hiện sự nhân lên của mình theo cơ chế bổ xung, thường là 12-24h sau khi bị nhiễm.Trong vòng 24-72 h tiếp theo các loại protein cần thiết đc tổng hợp sau cùng là protein vỏ bọc polyhedrin Hiện nay có một số loại baculovirus đang được ngiên cứu sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh họcAcMNPV ( Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )HzSNPV ( Helicoverpa zea Single Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )OpMNPV ( Orgyia pseudotsugata Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )LdMNPV ( Lymantria dispar Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )- Polyhedrin có tác dụng bảo vệ virus với môi trường ngoại cảnh, nhưng so với loại protein khác của virus, thì loại polyhedrin này không thực sự cần thiết cho lắm trong chu kỳ nhân lên của virus.- Protomer của polyhedrin là một protomer mạnh. Lợi dụng đặc tính này, người ta đã thiết kế baculovirus làm loại virus vector biểu thị gen ngoại lai ( expression vector ).- Hiện nay loại AcMNPV đc thiết kế với mục đích đó. Người ta cắt bõ hoàn toàn gen polyhedrin nhưng vẫn giữ protomer của nó. Thay vào đó, người ta đã nối một chuổn MCS ( multiple cuting site = vùng cắt của các enzym hạn chế ) để làm vùng tiếp nhận gen ngoại lai.Phát triển baculovirus làm thuốc trừ sâu sinh họcDùng baculovirus tự nhiênDùng baculovirus tái tổ hợpĐối với baculovirus tự nhiênKhông gây độc đối với người và động vậtThay thế đc 1 số thuốc trừ sâu độc tồn dư trên sản phẩm, gây hại cho đối tượng tiêu thụTrong điều cho phép người ta khuyến khích dùng thuốc trừ sâu sinh học đặc biệt là baculovirus vì chúng an toàn hơn, dễ sản xuất và giá thành chấp nhận được.Hiện nay có 2 loại đc sử dụnngMỹHzSNPV, LdMNPV và OpMNPVAnhNeodiprion sertifer MNPV và Panolis MNPVPhương thức sữ dụngPhun chế phẩm có chưa baculovirus đã sản xuất lên cây cần bảo vệ đối với loại côn trùng thích ứng.Thời gian giết chết côn trùng kéo dài 3-4 ngàyBaculovirus có thể ẩn nhập polyhedra rất đề kháng với điều kiện tự nhiênĐối với baculovirus tái tổ hợpLàm sao giảm đc thời gian gấy chết côn trùng của baculovirus ? Phải chọn đúng virus thích hợp mới có tính gây bệnh caoPhải tăng cường tính gây bệnh của baculovirusTên gen được tái tổ hợpTác dụngThời gian gây chết giảmHocmon bài tiết DiuretinGiảm sự lưu thông haemolymph trong côn trùng.20%Nọc độc bò cạp ( AaIT )Bại liệt, co giật, tê liệt thần kinh30%-40%Nọc độc nhện ( Txp – 1) Bại liệt 30%-40%Có hai hướng chọn lọc các loại gen gây độc của côn trùng rồi tái tổ hợp vào baculovirus Chọn các gen thuộc nhóm sản xuất độc tố (toxin )Chọn các gen thuộc nhóm sx hoạt chất sinh học ( enzym, hormon ).Tái tổ hợp gen sản xuất toxin đặc hiệu gây chết côn trùng Gen sản xuất endotoxin có tên là Cry đc cắt và ghép vào baculovirus.Có hiệu lực thật sự, giảm thời gian gây chết đối với côn trùng nhưng thực tế xét về hiệu quả kinh tế chưa lớn lắm.Gen AaIT được tái tổ hợp vào baculovirusNâng cao hiệu lực gây chết của baculovirus tái tổ hợp. Thời gian gấy chết từ lúc nhiễm chỉ còn 2 ngày.Gen Txp-1Có hiệu lực tốtTái tổ hợp gen sản xuất hợp chất sinh học.- Có thể nói gen điều hòa hormon bài tiết ( diuretin hormone ) khi đc tái tổ hợp vào baculovirus có tác dụng gấy chết côn trùng nhanh, hiệu quả và phổ rộng.- Có nhiều loại côn trùng bị nhiễm baculovirus tái tổ hợp này hơn là baculovirus tái tổ hợp gen toxin, bởi lẽ toxin thường có tác dụng đặc hiệu cho từng lớp côn trùng nhất định.- Một hướng khác là tận dụng hormon sinh trưởng JHE ( Juvenile hormone esterase ). Côn trùng thường qua nhiều giai đoạn phát triển và lột xác. - Nếu ấu trùng bị nhiễm baculovirus tái tổ hợp chứ gen JHE, thì hormine này sẽ làm rối loạn quá trình sinh trưởng, đình trệ tiêu hóa và gây chết.Kết Quả Thực HiệnNgày nay độc tố diệt côn trùng của Bt sản bằng công nghệ sinh học và kỹ thuật tái tổ hợp gen đc sử dụng rộng rãi diệt các côn trùng sau:Loài bướm trắng, sâu bắp cải trông lĩnh vực trồng rau.Loài sâu cuốn bắp cải, gây hại bắp cải, rau, đậu.Loài sâu bông trông cộng nghiệp trồng sâu bôngLoài sâu thuốc lá trông công nghiệp trồng thuốc lá.Bọ khoai tây trông công nghiệp trồng khoai tâyCác loài sâu phá hoại 1 số cây rừng.Ấu trùng muỗi chống bệnh sốt rét, sốt xuất huyết.Tái tổ hợp gen sản xuất độc tố của Bt để sản xuất bằng con đường CNSH, đã chủ động để có độc tố thành phẩm phòng chống côn trùng.Cũng bằng KT CNSH phân tử, người ta tiến hành chuyển nạp các loại plasmid có mang gen độc tố từ các nguồn khác nhau vào các loại Bt khác nhau trong tự nhiên , để chúng có khả năng sản xuất các loại độc tố diệt côn trùng khác nhau.Baculovirus- Baculovirus tái tổ hợp gen ngoại lai gây độc cũng như baculovirus tự nhiên được sản xuất theo phương pháp kỹ thuật gen và CNSH đã góp phần to lớn phá hoại côn trùng gây hại mùa màng trên thế giới.- Tuy nhiên, người ta lo ngại các gen độc ( đặc biệt là gen toxin ) sản xuất toxin như vậy, liện có gây độc cho các đối tượng khác.- Khía cạnh lo ngại như vậy là hoàn toàn có căn cứ, nhưng chúng ta có thể yên tâm, vì baculovirus là loại virus hoàn toàn đặc hiệu gây bệnh hại cho côn trùng, do vậy dù baculovirus đc tái tổ hợp gen sản xuất sản phẩm độc, chúng cũng không gây nhiễm đc cho động vật bậc cao.- Khi không gây nhiễm đc, thì không có quá trình nhân lên, không sản xuất ra các sản phẩm protein ngoại lai, trong đó có chất độc sinh học do gen ngoại lai sản xuất.Tài liệu tham khảo1. Công Nghệ Sinh Học Đối Với Vật Nuôi Và Cây Trồng- GS.Ts Đái Duy Ban_Ths. Lê Thanh Hòa.2. Công Nghệ Sinh Học Trong Bảo Vệ Thực Vật – PGS.Ts Phạm Thị Thùy3. Tuyển Tập Công Trình Nghiên Cứu Bảo Vệ Thực Vật 1990-1995 – Viện Bảo Vệ Thực Vật.4. Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý môi trường- PGS.TS. Nguyễn Xuân Thành. 5. Thực Trạng Về Sản Xuất Và Ứng Dụng Các Chế Phẩm Vi Sinh Vật Để Phòng Trừ Dịch Hại Cây Trồng ở Việt Nam Trong 20 Năm Qua – PGS.Ts Phạm Thị Thùy.6. Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng thuốc sâu sinh học (Bt, NPV, nấm Bb, Ma) thế hệ mới trừ sâu trong sản xuất rau an toàn- PGS.Ts Phạm Thị Thùy7. Tuyển tập công trình Nghiên cứu chuyển giao khoa học và công nghệ, nhân 40 năm thành lập Viện BVTV –NXB Nông NghiệpCám ơn thầy và các bạn đã chú ý lắng ngheDanh sách nhómTrần Lê Tấn Lộc14132179Nguyễn Thị Hồng Thư 14132085Lư Xuân Dứt14132013Lê Minh Nhựt14132197Nguyễn Lê Hoài11158069