Đề tài Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam

LỜI CẢM ƠN! Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình, không chỉ là sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi còn nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô cũng như sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè. Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Lê Thị Liên – Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang đồng kính gửi thầy PGS.TS Đinh Duy Kháng – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo, dìu dắt và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Bạch Như Quỳnh người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình. Tôi cũng xin cảm ơn các cô chú, anh chị đang công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử – Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đó. Để có được những hiểu biết về kiến thức chuyên ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện cho tôi được học tập trong môi trường giảng dạy tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khóa luận của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Sinh viên Đỗ Thị Hồng MỞ ĐẦU Đặt vấn đề: Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thủy cầm, đặc biệt là ở gà do virus cúm type A thuộc họ Orthomysoviride gây nên. Trong các phân type cúm A thì phân type H5N1 là phân type có độc lực cao nhất và gây chết gia cầm hàng loạt, gây thiệt hại rất lớn cho con người và kinh tế. Năm 1997 dịch cúm bùng phát tại Hồng Kông sau đó lan sang các nước châu Á, châu Âu, châu Phi. Theo tổ chức y tế thế giới (OIE) có 55 quốc gia trên thế giới nhiễm dịch cúm A/H5N1 tính từ năm 2003 [12]. Và ở việt Nam, dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện là vào tháng 2 năm 2003 và chỉ trong thời gian ngắn đã lây lan ra 57 tỉnh thành trên cả nước gây thiệt hại lớn cho nghành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng tới nhiều mặt của đời sống kinh tế, xã hội. Theo Cục Thú y, trong năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại 64 xã, phường của 38 huyện 23 tỉnh, thành trên cả nước. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là hơn 147 nghìn con, trong đó chủ yếu là vịt. Đáng lo ngại là tại khu vực Đồng bằng Bắc bộ, nơi chăn nuôi số lượng lớn gia cầm đã tái phát dịch cúm tại tỉnh Nam Định, tỉnh Nghệ An cũng đã có loại dịch bệnh nguy hiểm này. So với năm 2009, thì năm 2010, số địa phương xuất hiện dịch cao hơn, trong đó có đến 11 tỉnh xuất hiện dịch 2 năm liền [6]. số ổ dịch của năm 2010 thấp hơn nhưng số tỉnh có dịch cao hơn, cho thấy sự phân bố về mặt không gian của các ổ dịch phân tán hơn. Trong thời gian từ năm 2003 đến 2010, toàn quốc có 119 ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người, trong đó có 59 ca tử vong. Hiện nay, cả nước còn 3 tỉnh là Lạng Sơn, Nam Định và Kon Tum có dịch cúm gia cầm [1]. Do virus cúm gia cầm H5N1 có tốc độ tiến hóa nhanh, có độc lực cao và rất dễ lây lan bùng phát thành dịch lớn. Bên cạnh đó các biện pháp phòng, chống dịch đặc biệt là nhận thức của người chăn nuôi về tính chất nguy hiển của dịch cúm còn rất hạn chế, tỷ lệ tiêm vacine cúm gia cầm còn thấp… Chính vì vậy vấn đề nghiên cứu và sản xuất vacine phòng chống cúm gia cầm là vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết. Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài “Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam”. Đề tài góp phần ứng dụng vào việc sản xuất vacine cúm A/H5N1, phòng bệnh trên gia cầm tại Việt Nam. Ý nghĩ khoa học và ý nghĩa thực tiễn: - Ý nghĩa khoa học: Xác định được trình tự gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine. - Ý nghĩa thực tiễn: Sử dụng chủng NIBRG-14 này vào việc sản xuất vacine. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Đối tượng nghiên cứu: Virus cúm chủng NIBRG-14 - Phạm vi nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên HA từ chủng NIBRG-14. - Địa điểm nghiên cứu: Phòng vi sinh phân tử - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Và Công nghệ Việt Nam. - Thời gian nghiên cứu: Từ 23/02/2011 đến 22/05/2011 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về dịch cúm gia cầm. Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do siêu virus cúm gây ra cho các loài gia cầm và chim hoang dã. Bệnh lây lan rất nhanh, tỉ lệ chết là 100% nếu gà bị bệnh. Đặc biệt có thể xâm nhiễm cho một số loài động vật có vú. 1.1.1. Lịch sử cúm gia cầm. - Bệnh được ghi nhận từ hơn 400 năm nay. - Tiếng anh: Influenza xuất phát từ tiếng Ý (Influence of the start). a. Cúm gia cầm xuất hiện trên thế giới: - Năm 1878 phát hiện bệnh ở Italia. - Năm 1901 phát hiện căn nguyên siêu nhỏ. - Năm 1955 phát hiện được virus gây bệnh. - Trận đại dịch đầu tiên: năm 1850 [12]. Một số đại dịch cúm đã xảy ra: - Đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 - 1919. - Đại dịch cúm Châu Á năm 1957 - 1958. - Đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 – 1969 [12]. b. Ở Việt Nam, dịch cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên vào 12/2003. Chia làm 3 đợt: - Đợt 1: 12/2003 đến 30/03/2004 ở 57 tỉnh. - Đợt 2: Từ tháng 4 đến tháng 11/2004, ở 17 tỉnh. - Đợt 3: 12/2004 đến 24/01/2005, ở 36 tỉnh [6]. 1.1.2. Nguồn lây nhiễm cúm A/H5N1 Bằng chứng sinh học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấy thủy cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A và từ đó truyền lây sang các vật chủ khác như: ngựa, lợn, gà, người… rồi gây bệnh và gây dịch ở các loài này. Gà bị nhiễm virus cúm thải virus qua đường mỏ hoặc qua phân sau đó người hoặc động vật ăn phải. Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước và nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lây truyền virus trong các quần thể động vật và người [12]. Sự lây nhiễm virus cúm sang người có thể xảy ra theo hình ảnh sau: Hình 1.1: Con đường lây truyền virus cúm sang người [12]. Sự trộn kháng nguyên (Antigen shift) là những biễn đổi lớn, đột ngột và vật liệu di truyền thường là do sự tái tổ hợp di truyền giữa hai chủng virus. Lệch kháng nguyên (Antigen drift) là những biến đổi nhỏ, từ từ, thường do đột biến xảy ra liên tục theo thời gian trong cùng một chủng virus. Cả hai kiểu biến đổi di truyền này đều tạo ra những chủng virus mới mà không được nhận ra bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, kháng thể chống lại những virus cũ không còn nhận ra và đáp ứng miễn dịch được và kết quả là gây ra các trận dịch lớn, nguy hiểm [11]. 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng. a. Triệu chứng. - Thời gian ủ bệnh rất ngắn 1 - 3 ngày - Gà nhiễm bệnh có những triệu chứng: + Viêm đường hô hấp cấp: Thở khó, khi thở phải há miệng, ho khẹc, chảy dịch mắt, dịch mũi và rớt dãi liên tục. Nhiệt độ cơ thể tăng đột ngột 40 - 450C. + Viêm đường tiêu hóa cấp: Tiêu chảy rất nặng, phân xám vàng, xám xanh, đôi khi có lẫn máu, mùi phân tanh. + Nhiễm trùng huyết: Mào và tích sưng, tích nước, xuất huyết điểm đỏ từng đám. Kết mạc mắt sưng chũng và xuất huyết, xuất huyết dưới da, đặc biệt xuất huyết ở cả da chân [1,7]. - Triệu chứng bệnh cúm gà ở người: Người nhiễm cúm gà có 3 hội chứng chính: + Hội chứng hô hấp: Hắt hơi, sổ mũi, mắt đỏ, chảy nước mắt, sợ ánh sáng, cảm giác rát họng, khô họng. Khó thở cấp tính, viêm thanh quản, khí quản, ho khan, khàn tiếng. + Hội chứng nhiễm trùng: Sốt cao liên tục, mặt đỏ, viêm kết mạc mắt. Chán ăn, lưỡi trắng. Mệt lả, đuối sức, chảy máu cam, hiếm nhưng quan trọng. + Hội chứng đau: Nhức đầu nhiều vùng trán, đôi khi lan khắp đầu. Đau bắp cơ: Thường gặp ở thắt lưng, chi dưới. Cảm giác nóng, đau vùng xương ức [1]. b. Bệnh tích Mổ khám gà bệnh thấy: - Mũi viêm xuất huyết và tịt lại. - Mào và tích xưng chũng, đỏ sẫm, tích nước. - Viêm hoại tử, xuất huyết tràn lan ở các phủ tạng: Phổi, tim, gan, lách, thận, buồng trứng… - Xuất huyết đỏ sẫm từng mảng ở các tổ chức dưới da và cơ. - Tuyến tụy xưng to có các vạch vàng và đỏ xen kẽ. - Viêm xuất huyết toàn bộ niêm mạc dạ dày, ruột non, ruột già, manh tràng, hậu môn, túi frabrieius [7]. 1.1.4. Tình hình dịch bệnh. 1.1.4.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới. - Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918: Dịch cúm diễn ra năm 1918 - 1919, còn được biết tới với tên cúm Tây Ban Nha, là đại dịch cúm lan rộng gần như ra toàn cầu. Đại dịch này hoành hành ở châu Âu, châu Mỹ và lan nhanh sang châu Phi, tới tận Bắc cực và các đảo Thái Bình Dương xa xôi. Khoảng 500 triệu người, tức 1/3 dân số thế giới khi đó nhiễm bệnh với số người chết ước tính ít nhất 50 triệu người, trong đó riêng ở Tây Ban Nha là 8 triệu người [10]. Hồi năm 2005, các nhà khoa học tại Trung tâm Kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Mỹ đã khai quật thi thể của một người chết vì virus cúm Tây Ban Nha và qua nghiên cứu, họ phát hiện ra virus này hầu như chắc chắn có nguồn gốc từ gia cầm và có chung các đột biến gen với dòng virus cúm gia cầm H5N1 hoành hành tại các nước châu Á hồi đó. Cúm Tây Ban Nha cho tới nay vẫn được coi là đại dịch nghiêm trọng nhất lịch sử loài người, thậm chí còn được cho là đại dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch [12]. - Đại dịch cúm châu Á 1957: Sau đại dịch 1918, dịch cúm trở lại “hiền lành” cho tới tận đầu những năm 1950. Năm 1957, thế giới bắt đầu tiến hành theo dõi hoạt động của căn bệnh cúm. Dù các phương tiện phục vụ cho việc này chưa được hiện đại như ngày nay, người ta sớm phát hiện thấy một dấu hiệu bùng dịch xuất hiện ở khu vực châu Á [12]. Virus được xác định đã bắt nguồn từ Quý Châu, Trung Quốc, lan sang Singapore vào tháng 2/1957, chạm tới Hồng Kông vào tháng 4 và Mỹ vào tháng 6. Có 69.800 người Mỹ thiệt mạng trong khi con số người chết toàn cầu dao động từ 1 triệu – 4 triệu người. Người ta đã chế tạo thành công một loại vaccine để kiềm chế căn bệnh này. Dịch cúm châu Á lần đầu tiên cung cấp cơ hội cho giới khoa học nghiên cứu hoạt động lây nhiễm tiền dịch bệnh chuyển thành dịch ra sao. Cúm châu Á biến mất sau 11 năm xuất hiện và biến đổi thành cúm Hồng Kông vào năm 1968 [12]. - Đại dịch cúm Hồng Kong 1968: Dịch cúm Hồng Kông được xác nhận là dịch cấp độ 2, gây ra bởi mẫu virus cúm A/H3N2, chính là hậu duệ của cúm châu Á H2N2. Thông tin đầu tiên về trận dịch là một vụ bùng dịch nhỏ ở Hồng Kông xuất hiện vào ngày 13/7/1968, trong một khu vực có khoảng 500 người sống rất gần nhau. 2 tuần sau, dịch bệnh bùng nổ mạnh và kéo dài khoảng 6 tuần. Tháng 7/1968, dịch xuất hiện ở Việt Nam và Singapore. Tới tháng 9/1968, nó đã lan tới Ấn Độ, Philippines, bắc Australia và châu Âu. Cùng tháng đó, virus đã vươn tới California từ những người lính trở về sau chiến tranh Việt Nam. Virus vươn tới Nhật Bản, châu Phi và Nam Mỹ vào năm 1969. Tổng cộng trong hai năm 1968 – 1969, trận dịch đã giết hại khoảng 1 triệu người trên toàn cầu trước khi nó biến mất [12]. Hình 1.2. Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến 15/09/2008) [12]. Chú giải: Phần bôi đậm là vùng dịch cúm xảy ra trên gia cầm. Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã. 1.1.3. Tình hình dịch cúm ở Việt Nam. Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến tháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau: - Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc thiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này [6]. - Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút. Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong [6]. - Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: Dịch cúm gà xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút). Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005 [6]. - Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ [6]. - Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước. Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007 [6]. - Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được khống chế trên toàn quốc [6]. - Cúm gà 2010 và đầu năm 2011(chủ yếu là bệnh cúm thuộc chủng H5N1). Tại tỉnh Bắc Kạn từ ngày 19/3 đến ngày 6/4 năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 16 hộ chăn nuôi tại huyện Lương Phú. Tổng số gia cầm bị chết và tiêu hủy tại các hộ gia đình trên là 318 con [6]. Tại Quảng Ninh, ngày 29/3, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 4 hộ gia đình thuộc xóm 4 xã Tiền Phong của huyện Yên Hưng. Tính đến ngày 6/4 tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ của 4 hộ trên là 1.554 con (trong đó có 1.504 vịt và 50 gà). Ở huyện Yên Hưng, Quảng Ninh, có hơn 3.000 con gà có biểu hiện mắc bệnh, số gia cầm bị chết là 1420 con [6].  Cả nước còn 6 tỉnh là Nghệ An, Khánh Hòa, Tuyên Quang, Bắc Ninh, Bến Tre và Quảng Ninh có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày. Số ca mắc cúm A/H5N1 trong những tháng đầu năm 2010 có thể nói là “bất thường” so với những năm trước đó chỉ trong 2 tháng đầu năm đã bằng tổng số ca mắc cả năm 2009. Đầu năm 2011 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra ở một số tỉnh nhưng với số lượng ít và hầu như chưa bùng phát thành dịch: Ngày 17/2, chi cục thú y tỉnh Kon Tum đã xác địnht trên 2.000 con chim cút và trên 1.000 con gà bị chiễm cúm A. Ngày 12/3, TS Lê Hữu Hải, Trưởng phòng NN&PTNT huyện Cai Lậy (Tiền Giang), cho biết bảy đàn gia cầm, thủy cầm hơn 4.700 con ở các xã Nhị Mỹ, Tân Phú, Nhị Quý, Hội Xuân và Mỹ Phước Tây của huyện Cai Lậy đã phải tiêu hủy vì có các triệu chứng của bệnh cúm A/H5N1 [6]. Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 19/6/2008 [12]. 1.2. Virus cúm A 1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc. * Đặc điểm hình thái: Hình 1.3: (A): Hình thái virus cúm; (B): Cấu trúc virus cúm; (C): cấu trúc RNA của virus cúm. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 – 120nm, đôi khi có dạng hình sợi. Khối lượng phân tử khoảng 250 Da. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [10]. * Đặc điểm về cấu trúc: Hạt virus: Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [2,17]. + Gai H giúp virut gắn lên thể thụ cảm trên bề mặt tế bào. + Gai N có tác dụng thoái biến thể thụ cảm của tế bào và giúp virus phóng thích tế bào bị nhiễm. - Vỏ bọc ngoài (envelope) - Lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand. RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA) là vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A, gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [2]. 1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng Hình 1.4. cấu trúc virus cúm A Tất cả các virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn. Trên bề mặt virus có protein ngây ngưng kết hồng cầu là HA và một loại enzyme NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào vật chu và giải phóng virus. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, hệ gen virus cúm A có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotit [16]. Các gen mã hóa cho các protein và chức năng của chúng như sau: - Phân đoạn 1: Là các gen mã hóa cho protein PB2 với kích thước 2341bp có vai trò trong quá trình sao mã: gắn mũ. - Phân đoạn 2: Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài, kích thước 2341bp, mã hóa cho protein PB1. - Phân đoạn 3: Mã hóa cho protein PA, kích thước 2233 bp, có vai trò trong quá trình sao mã. - Phân đoạn 4: Liên kết với tế bào thụ thể trên tế bào chủ gây ngưng kết hồng cầu, kích thước đoạn gen là 1778 bp mã hóa cho protein HA (Hemagglutinin). - Phân đoạn 5: Mã hóa cho protein NP, kích thước 1565 bp, nucleotit bám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã, vận chuyển ra vào nhân của vRNA. - Phân đoạn 6: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng của virus, kích thước 1413 bp, mã hóa cho protein NA (Neuraminidase). - Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrix protein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virus. - Phân đoạn 8: Kích thước 890 bp, mã hóa NS1 với chức năng là protein không cấu trúc liên quan đến sự vận chuyển của RNA, ức chế interferon. Mã hóa prtein NS2 là protein không cấu trúc, chức năng chưa được biết rõ. Hình 1.5. Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 [3]. * Độc lực gây bệnh của virus cúm A: Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế sức đề k