Đề tài Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC

- 3 - -----

----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC.” - 4 - MỤC LỤC PHẦN 1: TỔNG QUAN ...........................................................................- 3 - 1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN .................................................- 7 - 1.1.1. Công thức cấu tạo ...........................................................................- 7 - 1.1.2. Tính chất lý hóa ..............................................................................- 7 - 1.1.3. Nguồn gốc ........................................................................................- 7 - 1.1.4. Dược động học ................................................................................- 7 - 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng ..........................................................- 8 - 1.1.6. Chỉ định ...........................................................................................- 8 - 1.1.7. Chống chỉ định ................................................................................- 9 - 1.1.8. Dạng bào chế và liều lượng ............................................................- 9 - 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN ........- 9 - 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh ......................- 9 - 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] .......................................................................- 9 - 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] ....................................................................... - 10 - 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] ............................................................ - 10 - 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS .................................................................................................... - 11 - 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] ...................................................................... - 11 - 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] .................................................................... - 11 - 1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC ..................... - 12 - 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] ...................................................................... - 12 - 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] ............................................................ - 12 - 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] ...................................................................... - 13 - 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] ..................................................................... - 13 - 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] ...................................................................... - 14 - 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] ....................................................................... - 14 - 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9] ....................................................................... - 15 - 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .......................................................................................... - 16 - 1.3.1. Nguyên tắc ..................................................................................... - 16 - 1.3.2. Cơ sở lý thuyết .............................................................................. - 17 - 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC ............................................ - 17 - 1.3.3.1. Hệ thống bơm .............................................................................. - 17 - 1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi ......................... - 17 - 1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu ................................................................................ - 17 - 1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC ................................................................. - 18 - 1.3.3.5. Detector trong HPLC .................................................................. - 18 - 1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả ............................................................... - 18 - - 5 - 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký .............................. - 19 - 1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ..................... - 21 - 1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] ............................................... - 21 - 1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] .................................... - 22 - 1.3.5.3. Chọn đệm pH ............................................................................... - 23 - 1.3.5.4. Tốc độ dòng ................................................................................ - 23 - 1.3.6. Cách đánh giá pic ......................................................................... - 23 - 1.3.7. Ứng dụng của HPLC .................................................................... - 24 - 1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết: ..................................................... - 24 - 1.3.7.2. Sắc ký điều chế: .......................................................................... - 24 - 1.3.7.1. Định lượng: ................................................................................ - 24 - PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................... - 26 - 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ... - 26 - 2.1.1. Nguyên vật liệu : ........................................................................... - 26 - 2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: ............................................................. - 26 - 2.1.1.2. Dụng cụ: ...................................................................................... - 26 - 2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................ - 26 - 2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu ............................................................. - 26 - 2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................... - 27 - 2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................... - 28 - 2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC ............................................................................... - 28 - 2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký ....................................... - 28 - 2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: .......................................... - 28 - a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp ...................................................... - 28 - Hình 1: Phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin 0,02% ............................. - 29 - b. Lựa chọn cột:........................................................................................ - 29 - c. Lựa chọn đệm: ...................................................................................... - 29 - d. Lựa chọn pha động: .............................................................................. - 30 - e. Lựa chọn tốc độ dòng ........................................................................... - 30 - đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn ..................................................................... - 31 - 2.2.2. Qui trình định lượng .................................................................... - 31 - 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống ........................................... - 32 - 2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................. - 32 - 2.2.2.3. Điều kiện sắc ký .......................................................................... - 33 - 2.2.2.4. Tính kết quả ................................................................................. - 33 - 2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng ........................................................................................................ - 34 - 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng .............................................. - 35 - 2.2.4.1. Tính tuyến tính .......................................................................... - 35 - - 6 - 2.2.4.2. Tính chính xác ........................................................................... - 37 - 2.2.4.3. Tính đúng ................................................................................... - 37 - Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp ............................. - 38 - 2.2.4.4. Tính đặc hiệu ............................................................................. - 39 - 2.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ ............................................................. - 40 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... - 43 - 3.1 KẾT LUẬN ....................................................................................... - 43 - 3.2 ĐỀ XUẤT .......................................................................................... - 43 - - 7 - PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 1.1.1. Công thức cấu tạo C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. Tính chất lý hóa Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether. Góc quay cực riêng [α]D20 : +1380 đến +1480[7] 1.1.3. Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán tổng hợp từ kanamycin B [7]. 1.1.4. Dược động học Tobramycin hầu như không hấp thu qua đường tiêu hoá nhưng hấp thu tốt qua đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết - 8 - tương. Do phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não. Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận. Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính. Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ở người giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6] 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận. Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin. Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]. 1.1.6. Chỉ định Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-). - 9 - Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc benzylpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2] 1.1.7. Chống chỉ định Người có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận. [2] 1.1.8. Dạng bào chế và liều lượng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ. Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %. Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P. aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11] 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trường định lượng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Thạch : 15,0 - 20,0 g - 10 - Nước cất : 1000 ml pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15] 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] - Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trường định lượng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nước cất : 100 ml pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml. - Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III. 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phương pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - 11 - - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc - Dung dịch chuẩn Cân chính xác một lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5οC đến 15οC và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). - Dung dich thử: Cân chính xác một lượng tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực). 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] Cân một lượng tobramycin sulfat tương ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO4. Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút. Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin. Mẫu trắng tiến hành như mẫu thử nhưng không có tobramycin. Sau khi đun cách thuỷ ở 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm. 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 12 - Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer được áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml. 1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm). - Nhiệt độ cột: 55 0C. - Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nước đã loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nước đã loại CO2. Tốc độ 0,3 ml/phút. - Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tương tự. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong khoảng 800 ml nước, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều. - Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. - Detector UV: 365 nm. - 13 - - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,004 N. - Các dung dịch chuẩn và thử được tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4- dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trước khi tiêm sắc ký. 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - Cột Purospher STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 µm, Merck). - Pha động: Acetonitril - nước (50:50). - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút. - Detector UV: 230 nm. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 µg/ml trong nước. - Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 700C. 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] - Cột Xterra RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 µm). - Nhiệt độ cột: 30 0C. - Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1 lít nước Milli - Q. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha động A đến 11,0. - Pha động B: Acetonitril. - Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau: Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 0 100 0 10 0 100 - 14 - - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Detector: Khối phổ. - Thể tích tiêm: 4µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch NaCl 0,9 %. 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5µm). - Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] - Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút. - Thuốc thử tạo dẫn chất: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic. - Detector UV: 340 nm. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm phosphat pH 7,4. - Dung dịch chuẩn và thử được tạo dẫn xuất với thuốc thử acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70 0C. 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] - Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5µm) - Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µm - Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. - Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml - 15 - dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc đều. - Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nước. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nước tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm (pha theo BP 2005). 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9]  Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thêm 0,5 ml thuốc thử X, đem đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.  Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Tiến hành tương tự như dung dịch thử nhưng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu). - Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5µm). - Detector UV : ở = 215 nm. - Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80 - Thể tích tiêm: 10 µl. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm. * Nhận xét: Qua các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận thấy: