Đồ án Công nghệ cố định enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TP Hồ Chí Minh, 6/2011 NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011 Chữ ký của giáo viên LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu của mình giúp tôi hoàn thành đồ án. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dư /V iii ~ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor 27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định 32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD-L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ’ .’ 34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34 Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L- GLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme 4 Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15 Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase 18 Chương 1: TỔNG QUAN Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose. Sau đó ữên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về enzym không hòa tan được ứng dụng vào thực tế. Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzym như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot. Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể. Năm 1963, Bemfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide. Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase. Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định. Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Theo phương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân. Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase. Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao. Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định. Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học. Sơ luợc về enzym cố định Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói môi trường dung dịch phàn ứng. Pha enzym không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym được cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm như sau: Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau: Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm. Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi. Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten nhưng có một số sai khác nhất định: Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang. • Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang. Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại. Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do. Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do. Ưu nhược điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài. Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó không gây ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang - enzym ra khỏi dung dịch cơ chất. Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do. Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục. Nhươc điểm: Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym. Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định. Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý. Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1] Phương pháp hóa học Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị Liên kết giữa enzym và chất mang là Mên kết bền, do đó hạn chế tối đa sự mất mát enzym trong quá trình phản ứng. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định. Phương pháp gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Tạo được Mên kết rất bền trước các tấc nhân pH, nhiệt độ... Thường được dùng phối họp với các phương pháp khác. Chi phí cao, thao tác thực hiên tương đối phức tạp. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quấ trình cố định. Phương pháp vật lý Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên chất mang bằng tác nhân vật lý Thao tấc thực hiện đơn giản. Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của enzym trong quá trình cố định. Có khả năng tái sử dụng chất mang. Do lực tương tác giữa enzym và chất mang yếu nên dễ xảy ra hiện tượng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzym cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trường. Phương pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản. Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo Mên kết nên phù họp với nhiều loại enzym. Hiệu quả cố định enzym cao. Có thể cố định đồng thòi nhiều enzym. Chỉ thích họp cho phản ứng với cơ chất có khối lượng phân tử nhỏ. Phương pháp hóa hoc: Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Phương pháp vât lý: Hấp phụ enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý như sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls.... Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể. 1.2.5. Vật liệu cố định [1] Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của quá trình cố định enzym Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích họp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích họp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ. Vât liêu vô cơ: Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn. Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel... Vât liêu hữu cơ: Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, - COOH, -OH, -SH,... nên dễ kết gắn với enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. • Các polymer tư nhiên: Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzym như lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase. Nhược điểm của tinh bột là độ trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt. Cellulose và dẫn xuất của Cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose... là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline). Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh. Cellulose thường được dùng để hấp thụ, hên kết ion, Mên kết cộng hóa trị với enzym hoặc nhốt trong gel. Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm 1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose. Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2- deoxy-ß-D-glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên kết ß-l,4-glycoside. Chitin có trong thành phần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,...Chitin là một vật Mệu có chứa nhóm chức -OH và cho Mên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các Mên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp thụ và Mên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde. Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm lượng lớn để hình thành nên lóp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác...). về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ờ ceUulose. Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2. Chitosan có thể cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan. Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid dipic, acid acetic. Chitosan là một polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, cấc nhóm hydroxyl có thể tham gia phàn ứng hóa học. Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2 dùng để nhốt tế bào, enzym. Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,... thường có khả năng dễ tạo màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn. • Các polymer tone hơp: Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,... Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu lỗ. Nhược điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tương họp sinh học kém, không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường. 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1] Ảnh hưởne của chất mans Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo nước và kỵ nước,.. .đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan. Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym tan. Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối liên kết hydro và liên kết kỵ nước Ảnh hưởns của vH Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất mang tích điện dương cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan. Ảnh hưởne của enzyme Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là sự tương tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết. Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang. /N/ 'J /%/ Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian do đó ft ảnh hường đến hoạt tính. Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như liên kết kị nước, liên kết hydro,... nên enzym dễ bị giải hấp phụ. Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưói các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúc không gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi đáng kể. Khi cố định bằng phương pháp bao gói, quá trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào hai yếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình. Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Enzym p-galactosidase Giói thiệu về enzym Ịỉ-galactosỉdase [2] Enzym P-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng P-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sàn phẩm từ sữa. Enzym này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hon là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục. Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhưng việc sử dụng enzym P-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó. Nguồn thu nhận enzym p-galactosỉdase [2] Enzym P-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khấc nhau có sự khác nhau rõ rệt. Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này. Bacteria: Alicyclobacỉllus acidocaldarìus subsp, Rittmannii Arthrobacter sp,_Bacittus acidocaldarỉus, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophỉlus, Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, Clostridium acetobutylicum, c.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E. cloaceae, Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilactỉ, p. pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, s. lactis, s. thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris. Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, p. chrysogenum, p. expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus. Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis, S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus. Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase [2] Phươns pháp hấữ phu vât lý Cấc chất vô cơ như nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,... chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,... được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định. Enzym ß-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis được cố định trên chitosan có hoạt độ riêng 0.9-2.2 u/mg trọng lượng khô của tế bào. Hoạt tính của enzym được cố định từ K. fragilis thì cao hơn nhưng