Đồ án Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

MỞ ĐẦU Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thơi gian gần đây là nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm qua, đó là những khám phá về cấu trúc hóa học và các cơ chế tác dụng kỳ diệu của enzyme- xúc tác sinh học. Enzyme đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong nghành công nghiệp hiện đại. Trước đây enzyme enzyme được dùng trong nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất thường được thu nhận từ động vật, thực vật. Trong những năm gần đây người ta bắt đầu chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền. Đó là nguồn enzyme được tách chiết từ vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh do đó có thể tạo ra một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme này có hoạt lực xúc tác rất cao. Do đó, chúng được ứng dụng cho nền sản xuất enzyme. Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao (giá trị buôn bán 187.2 triệu USD). Do đó, cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20 – 30%. Với để tài: “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm” nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống xã hội là rất cần thiết. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống và là chất xúc tác sinh học. Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. Enzyme không những có thể xúc tác cho phản ứng trong cơ thể sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia trong phản ứng do enzyme xúc tác gọi là cơ chất của enzyme, ký hiệu là S.E có tính đặt hiệu cao nghĩa là một emzyme chỉ tác dụng trên một hoặc một số cơ chất nhất định. Từ thập kỉ trước enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến nhưng mới chỉ có tính chất kinh nghiệm thuần tuý. Công nghệ enzyme ra đời là một bước bước phát triển ứng dụng của enzyme. Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới, một giai đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau như hoá học protein, sinh học phân tử….Do đó, có được những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc, động học….Tạo điều kiện để sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu quả ứng dụng ngày càng cao. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học cũng như enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không chỉ trong lĩnh vực truyền thống mà còn cả trong những vực mới tạo ra sản phẩm mới. 1.1. Tình hình nghiên cứu Trước thế kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần tuý người xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sản xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang…. Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemom người Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí trong quá trình lên men. Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóc học. Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn như công trình nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày. Công trình này do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Sapallanzani (người Ý) mở rộng. Các tác giả đã cho thịt vào ống kim loại và đưa vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá. Năm 1836, Schwann đã gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin). Từ năm 1800 người ta còn thấy rằng trong ruột còn có một enzyme phân giải protein khác. Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin. Nửa đầu thế kỉ XIX người ta đá tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men. Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme. Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hoá học của enzyme là protein….Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại để nghiên cứu enzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme. 1.2. Cấu tạo hoá học Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acid kết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm α - carboxyl của amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin của amino acid tiếp theo, loại đi một phân tử nước. Theo cách kết hợp này các liên kết peptid nằm trên một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu tận cùng gọi là “đầu N” (có nhóm α - amin tự do và amino acid thứ nhất), kí hiệu bằng dấu “+”và “đầu C” (có nhóm α - carboxyl tự do của amino acid cuối cùng, kí hiệu bằng dấu “-“. Đánh dấu thứ tự các gốc amino acid trong phân tử bắt đầu từ “đầu N” Trong một số trường hợp đầu N và đầu C có thể kết hợp với nhau, phân tử có cấu trúc vòng. Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme một thành phần hoặc protein phức tạp, gọi là protein hai thành phần hay holoenzyme. Phân tử holoenzyme bao gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải prorein gọi là coenzyme. Coenzyme có vai trò quan trọng để thực hiện chức năng xúc tác, loại bỏ coenzyme sẽ làm mất khả năng xúc tác. Trong một số trường hợp, chỉ riêng coenzyme cũng là chất xúc tác nhưng không hiệu quả bằng khi kết hợp với apoenzyme. Cùng một coenzyme khi kết hợp với apoenzyme khác nhau tạo thành các holoenzyme khác nhau, xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng. Coenzyme còn có vai trò làm bền enzyme. Apoenzyme có vai trò quan trọng với tính đặc hiệu của enzyme và tăng hiệu quả xúc tác của coenzyme.Coenzyme thường là các chất dẫn xuất của các vitamin hoà tan trong nước. Vì vậy khi thiếu một vitamin nào đó sẽ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme tương ứng trong tế bào, vi phạm quá trình trao đổi chất trong cơ thể, gây nên các bệnh đặt trưng. 1.2.1. Phân loại Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế đã trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loại enzyme. Người ta chia enzyme ra làm 6 lớp. 1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử. 2. Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị. 3. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân. 4. Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ưng phân cắt không cần nước. 5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá. 6. Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP… Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp). Tên enzyme thường được gọi: Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng thêm tiếp vĩ ngữ ase. 1.3. Tính chất Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động. Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein) 1.4. Cơ chế tác dụng ([5]) Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm. Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau. E + S → ES → P + E Hình 1.1. Cơ chế tác dụngcủa enzyme Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất. Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng trở lại trạng thái tự do ban đầu để quay vòng xúc tác. Hình 1.2. Một ví dụ minh họa sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5]) Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc tính và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hoá enzyme). Các yếu tố hoá lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu như đối với các phản ứng hoá học bình thường mà còn ảnh hưởng đến cấu trúc không gian, độ bền của cấu trúc không gian, độ tích điện của phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó. 1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ ([E]) Nói chung, trong điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào E]:v = k[E] V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme [E]3 [E]2 [E]1 v 20 40 60 80 Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc của phản ứng Nồng độ E quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc của phản ứng đã thay đổi theo thời gian. Theo sơ đồ này nên chọn nồng độ [E]3 sẽ có được sự phụ thuộc tuyến tính giữa V vào thời gian trong khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định vo. Do đó nên tiến hành lựa chọn nồng độ enzyme trước khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu động học phản ứng enzyme 1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phương trình hóa học biểu diễn theo phương trình động học Michaelis – Menten. Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu tại điểm đó, tất cả các phân tử enzyme đã thực hiện chức năng xúc tác của mình thì nó được gọi là tốc độ phản ứng tối đa với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của Enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hoà bởi cơ chất. 1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzyme, chất kìm hãm choán chỗ của cơ chất ở enzyme. Hình 1.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn. 1/v = (aKm/Vmax) 1/S +1/Vmax a = 1+[I]/KI Hình 1.5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất có kiềm hãm cạnh tranh Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xảy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có sự tương đồng về mặt hoá học chẳng hạn như malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic acid thành acid fumaric acid. Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự do. Hình 1.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp Hình 1.7. Kiểu kìm hãm hỗn tạp Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. 1.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong nước như Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ. 1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trừơng, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần. Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vô cơ thông thường. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C , cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao. 1.5.6. Ảnh hưởng của pH Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme. Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng xúc tác. 1.5.7. Các yếu tố khác Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại: có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ. Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh. Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme. Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng. 1.6. Nguồn thu nhận ([4]) Các loại enzyme hiên nay rất phong phú và đa dạng có thể thu từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật. + Động vật: có mặt trong tuyến tụy và nước bọt của động vật + Thực vật: có nhiều trong cây dứa, đu đủ xanh, trong dịch ép thân cây sung + Vi sinh vật: Bacillus, Penicillium, Pseudomonas, Rhizopus…. 1.7. Ứng dụng 1.7.1. Trong thực phẩm Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiện tại có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào như sản xuất sữa, bánh mì, bia, công nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa…… 1.7.2. Trong nông nghiệp Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất. 1.7.3. Trong y học Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh….. CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1. Tình hình nghiên cứu Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần đây giá trị của enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân (75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (59%) 2.2. Cấu tạo Nhóm enzyme protease (peptitd – hidrolase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptitd (-CO-NH-) trong phân tử protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acid amind. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Hình 2.1. Cấu trúc không gian của protease Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase. ([7]) Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại: Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid. Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti. Dựa vào động lực hcọ của cơ chế xúc tác, endo peptidase được chia thành 4 nhóm: Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính. Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, proteinase được phân loại đơn giản hơn thành 3 nhóm Proteinase acid: pH từ 2 – 4, Proteinase trung tính: pH từ 7 – 8, Proteinase kiềm: pH từ 9 – 10 2.3. Cơ chế tác dụng Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian. E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian) 2.4. Nguồn thu nhận Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn như các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật… Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày niêm mạc ruột non, tuyến tụy)…. Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi. Thực vật: Papain từ mủ thu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin