Đồ án Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ - fish (florescence in situ hybridization) trên vi sinh vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN MÔN HỌC CHUYÊN NGÀNH TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ_FISH (FLORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) TRÊN VI SINH VẬT GVHD : Th.s NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT MSSV : 60604096 TPHCM, tháng 6/2010 ii LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự thành kính, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: ƒ Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này. ƒ Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài. ƒ Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. iii TÓM TẮT NỘI DUNG Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) ra đời từ năm 1989 và đến nay được xem là công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài. Bằng 5 bước xử lý cơ bản: chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai, rửa mẫu, quan sát ta có thể thu được các thông tin chính xác về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay thành phần môi trường của đối tượng nghiên cứu. Trên thế giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH sẽ sử dụng để tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác. Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển. iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii TÓM TẮT NỘI DUNG ........................................................................................ iii MỤC LỤC ....................................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH VẼ ..................................................................................... vi DANH SÁCH BẢNG BIỂU ................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................... vii CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH ................................ 3 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH ............................................ 5 3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH ........................................................... 5 3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang .................................................. 6 3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ .................................................................. 10 3.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu ............................................... 11 3.5. Quan sát và xử lý tín hiệu ....................................................................... 11 CHƯƠNG 4. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH .................... 14 4.1. Kết quả không chính xác ........................................................................ 14 4.1.1. Các chất tự phát huỳnh quang ......................................................... 14 4.1.2. Đầu dò thiếu tính đặc hiệu .............................................................. 15 4.2. Kết quả âm tính ....................................................................................... 16 4.2.1. Số lượng đầu dò quá ít .................................................................... 16 4.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích ................... 17 4.2.3. Hàm lượng rRNA thấp ................................................................... 17 v 4.2.4. Ảnh chụp bị mất màu ...................................................................... 18 4.3. Biện pháp khắc phục ............................................................................... 18 CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH ........................................ 19 5.1. Sự đa dạng của vi sinh vật ...................................................................... 19 5.2. Hệ vi sinh vật trong nước thải ................................................................ 22 5.3. Vi khuẩn cộng sinh ................................................................................. 23 5.4. FISH trong y học .................................................................................... 24 5.4.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp ...................................................... 24 5.4.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng ........... 29 5.4.3. Nấm ................................................................................................ 30 5.4.4. Thuốc thú y ..................................................................................... 31 5.4.5. Các mầm bệnh ở thực vật ............................................................... 31 5.4.6. Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang ................................................................................................ 32 CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH ................................... 33 6.1. Trên thế giới ............................................................................................ 33 6.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 36 CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT ................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40 vi DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH .....................................................4 Hình 2: Các cách đánh dấu đầu dò ...........................................................................7 Hình 3: Kính hiển vi quét laze đồng tiêu ......................................................................... 11 Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans ....................................................................................................................... 12 Hình 5: Kết quả hiển thị cho quá trình lai để phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất ............................................ 19 Hình 6: Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng ......................... 22 Hình 7: FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I ....... 23 DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH ...........................................................................................................8 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ISH : In Situ Hybridization FISH : Florescence In Situ Hybridization rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid DNA : Deoxyribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction CCD : Charged Coupled Device CLSM : Confocal Laser Scanning Microscope TSA : Tyramid Signal Amplification CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Việc nhận biết sự có mặt của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chủ yếu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển bằng phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn môi trường đặc hiệu gặp khó khăn trong nghiên cứu các loài vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng chậm hoặc chưa phân lập. Một nhược điểm nữa là tốn nhiều thời gian và có tính chọn lọc cao. Hơn nữa, kỹ thuật này không phản ánh được sự mối tương quan giữa đối tượng nghiên cứu với môi trường xung quanh [9]. Từ thực tế trên, nhiều kỹ thuật hiện đại ra đời như PCR, lai liên tiếp, lai trình tự, tuy nhiên vẫn không khắc phục hoàn toàn những nhược điểm kể trên của kỹ thuật nuôi cấy cổ điển. Nguyên nhân chính là để thực hiện những kỹ thuật này đòi hỏi phải có một lượng mẫu lớn, điều này nghĩa là cũng phải đi qua giai đoạn cấy chuyền mất nhiều thời gian; và quan trọng hơn là các phương pháp hiện đại này chỉ chứng minh sự có mặt của đối tượng nghiên cứu mà không cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật. Kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời từ năm 1961 do hai nhóm nghiên cứu độc lập Pardue, Gall và John đề xuất đã khắc phục được tất cả các vấn đề kể trên. Tuy nhiên do tính không an toàn đối với con người, môi trường và khá phức tạp trong thao tác mà kỹ thuật ISH đã được cải tiến thành FISH. Lai huỳnh quang tại chỗ FISH (fluorescence in situ hydridization) từ khi ra đời đã trở thành một công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài. FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 2 thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu nhất. Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92]. FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi. Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển. Nhận thức được vai trò, tầm quan trọng và triển vọng phát triển của FISH trong nghiên cứu về thế giới vi sinh vật, tôi tiến hành đi vào tìm hiểu kỹ thuật này trong khuôn khổ bài báo cáo đồ án môn học. CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU 3 CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH Năm 1969 : kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời bởi hai nhóm nhà khoa học độc lập Pardue, Gall và John. Trong phương pháp này, DNA hoặc 28S-RNA có đánh dấu phóng xạ được đem lai với DNA có trong noãn bào chủng vi khuẩn Xenopus, sau đó được dò tìm bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Kỹ thuật này cho phép các chuỗi acid nucleic xâm nhập vào trong tế bào mà không làm chết tế bào, làm thay đổi đến hình thái của tế bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào. Khi phân tích ở cấp độ đơn bào bằng phương pháp lai tại chỗ có thể cung cấp một bức tranh chi tiết hơn về vi sinh vật so với lai dot blot. Nó không chỉ xác định được hình thái tế bào của một loài vi sinh vật chưa từng được nuôi cấy mà còn phân tích được sự phân bố không gian của chúng. Xác định số lượng các tín hiệu phát ra bằng các oligonucleotide rRNA đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng trưởng của các tế bào riêng lẻ. Từ khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài. Cuối cùng vào năm 1988, Giovanoni và cộng sự đã áp dụng thành công phương pháp này trên vi khuẩn, họ là những người đầu tiên sử dụng các đầu dò oligonucleotide rRNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ để phát hiện vi khuẩn thông qua kính hiển vi. Những năm sau đó, cùng với sự phát triển của các chất dán nhãn huỳnh quang [76,109,110], kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã dần dần được thay thế bởi thuốc nhuộm huỳnh quang. Năm 1989, DeLong lần đầu tiên sử dụng oligonucleotide được đánh dấu chất huỳnh quang để dò tìm các vi sinh vật đơn bào. So với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, kết quả thu được chính xác hơn và không cần phải thực hiện bước dò tìm (vì CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU 4 nhìn thấy trực tiếp). Hơn thế nữa, các đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu với nhiều chất nhuộm, phát xạ tại những bước sóng khác nhau, vì vậy có thể dò tìm một vài trình tự đích chỉ với một lần lai. Độ nhạy, sự chính xác và thời gian tiến hành ngắn là những ưu điểm nổi trội của FISH, giúp nó ngày càng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học nghiên cứu về vi sinh vật. CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 5 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH 3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào). Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau: - Chuẩn bị mẫu và đầu dò. - Cố định mẫu. - Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào. - Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai. - Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp). - Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả. Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 6 3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích [10,53]. Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ sở dữ liệu chung và thương mại [93,145], đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S [10,82,94,104,143], rRNA 18S [83,86,87,133] và gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH. Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào. Một đầu dò oligonucleotide điển hình thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở -200C trong tối khoảng vài tháng. CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 7 Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất bởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’ của đầu dò (hình 2a), hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò (hình 2b) [100]. Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [31]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu huỳnh quang [133]. Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn. Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang (Hình 2c) [162]. Độ nhạy của FISH còn có thể được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu. Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng vào định danh vi khuẩn (1996). Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm. Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thể này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 8 được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA) (Hình 2d). Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường. Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp. Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e) (Moter et al., 2000). Độ nhạy của FISH khi áp dụng trên các mẫu tự nhiên sẽ tăng lên đáng kể khi sử dụng đầu dò polyribonucleotide được đá