Hệ thống tái sinh

HỆ THỐNG TÁI SINH Hệ thống tái sinh Đặc điểm của hệ thống tái sinh Cơ sở khoa học của tái sinh cây 3. Các phương thức nuôi cấy tái sinh cây Môi trường nuôi cấy Các yêu cầu kỹ thuật chung Các loại Môi trường Hệ thống tái sinh Đặc điểm chung Khả năng tái sinh phụ thuộc: Dạng vật liệu ban đầu dùng để biến nạp (phôi non, mô sẹo, cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm, hoặc chồi …) Các yếu tố: kiểu gen, tuổi mô, các chất điều hoà sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng. Từ bất kỳ bộ phận nào của thực vật đều có thể tái sinh thành hàng ngàn thậm chí hàng triệu cá thể giống hệt cây mẹ Tính toàn năng của tế bào Hệ thống tái sinh Tính toàn năng của tế bào Hệ thống tái sinh Hiện tượng biệt hóa, phản biệt hóa và tái biệt hóa Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và qúa trình đó gọi là qúa trình phản biệt hóa. Thực vật: tế bào phôi non, tế bào mô phân sinh, tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra qúa trình phản biệt hóa. Các phương thức nuôi cấy – tái sinh Nuôi cấy tế bào đơn Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời Nuôi cấy mô phân sinh Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Nuôi cấy phôi Nuôi cấy protoplast Hệ thống tái sinh Nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn môi trường lỏng Dòng tế bào - Dòng tế bào cho phép tách riêng từng tế bào rất dễ dàng. - Các tế bào trong dòng tế bào có độ đồng nhất cao. - Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường có nhân to hơn, nguyên sinh chất đậm đặc hơn so với tế bào nguyên thủy trong mô thực vật. - Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường chứa nhiều hạt tinh bột (năng lượng dự trữ của thực vật). - Tế bào có khả năng phân chia trong khoảng 24 – 72 giờ. - Tế bào bị mất tính toàn năng. - Tế bào bị tăng mức bội thể. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời - Nuôi cấy mô so với nuôi cấy cơ quan tách rời đòi hỏi bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa N (axit amin) và đặc biệt là chất điều hòa sinh trưởng, vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp những chất này. Lựa chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt: mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển, đó là những phần non của cây hoặc phôi hợp tử trưởng thành như mầm, phần trên lá mầm, chồi bên của lá thứ nhất hay thứ hai, nơi chứa nhiều tế bào mô phân sinh. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây; nhân nhiều và nhanh cây in vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản như chọn dòng tế bào, đột biến soma Nuôi cấy mô phân sinh Mô phân sinh chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virus xâm nhập Nuôi cấy mô phân sinh được dùng trong các trường hợp: - Tạo ra những giống cây sạch virut từ những giống bị bệnh (phục tráng giống)- Nhân giống in vitro - Tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicine. - Nghiên cứu qúa trình hình thành cơ quan Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Nuôi cấy phôi Loài dại x loài trồng con lai có độ bất hợp cao nuôi cấy phôi cứu phôi Nuôi cấy phôi non Nuôi cấy phôi trưởng thành Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) - Chọn lọc các dòng tế bào vô tính có các tính trạng đặc biệt do sự di truyền của tế bào hoặc được tạo ra do xử lý đột biến. - Chuyển những đoạn ADN ngoại lai quy định những tính trạng mong muốn vào tế bào trần rồi tái sinh thành cây. - Dung hợp tế bào trần từ những loài cách xa nhau về mặt di truyền, không thể áp dụng lai hữu tính bình thường. Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast). Các tế bào trần sau khi được nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy Ánh sáng Chất dinh dưỡng Nhiệt độ Độ ẩm Phát sinh cơ quan, hình thành cây pH Khác.... Phải chọn được các điều kiện trên thích hợp để thực hiện được tính toàn năng của tế bào Ánh sáng Đòi hỏi đối với nguồn sáng Phát sinh cơ quan, hình thành cây Cường độ 1500-2000 LUX Chu kỳ chiếu sáng 16/24; hoặc 8/24 Chất lượng quang phổ: dải tần 230-780 nm Bóng tối đối với một số trường hợp như tạo củ, tạo callus Vai trò của ánh sáng Kích thích tạo diệp lục Cung cấp chất dinh dưỡng cho cây Ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Khi tạo callus, tạo củ, lưu giữ quỹ gen- cần cường độ ánh sáng thấp Có cường độ chiếu sáng tương đối đồng đều cho một mục đích sử dụng. Dùng ánh sáng lạnh để chống tăng nhiệt độ – thông dụng là đèn huỳnh quang. - Sử dụng thiết bị tắt mở tự động để tắt bật ánh sáng theo chu kỳ định trước, thường là 16 giờ chiếu sáng/8 giờ tối. Phương pháp bố trí ánh sáng trong phòng thí nghiệm Vai trò của nhiệt độ: duy trì sự phát triển bình thường của thực vật. Tuỳ theo mục đích người ta sử dụng các chế độ nhiệt độ khác nhau để sự sinh trưởng và phát triển của thực vật được tối ưu Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu thường dùng 25-27 độ C Lưu giữ quỹ gen dùng nhiệt độ thấp từ 4-20 độ Khi chuẩn bị cho cây ra ngoài có thể tăng dần nhiệt độ Phương pháp duy trì nhiệt độ phòng nuôi Ở Xứ lạnh – chủ yếu phải tăng nhiệt độ bằng sưởi, Ở Việt Nam – phải giảm nhiệt độ bằng điều hoà Ưu điểm: diện tích sử dụng lớn, giá thành rẻ. Thường dùng cho các mục đích chung, sản xuất đại trà. Ưu điểm: gọn nhẹ, có thể điều chỉnh các chế độ đặc biệt bổ sung cho buồng nuôi. Nhược điểm: giá thành cao Phương pháp duy trì nhiệt độ sử dụng tủ nuôi Được duy trì nhờ bình nuôi. Thường là độ ẩm bão hoà Độ ẩm Trước khi đưa ra ngoài, giảm dần độ ẩm bằng cách: Thay nút bằng nút giấy. Nút giấy cho phép độ ẩm thoát ra ngoài nhưng vẫn chống được nhiễm trong thời gian ngắn. Mở hẳn nút 2-3 ngày trước khi đưa cây ra ngoài để độ ẩm gần với độ ẩm tự nhiên. Đảm bảo vô trùng Chịu nhiệt; Cho ánh sáng đi qua Lưu giữ độ ẩm đảm bảo tiểu khí hậu Đảm bảo thông khí với môi trường bên ngoài Bình nuôi Bình tam giác Hộp vuông Bình trụ Túi nuôi cấy, ống nghiệm Khác Các loại bình nuôi Đảm bảo vô trùng Sử dụng nhiều lần Rẻ tiền Lưu thông với bên ngoài Thoáng khí Các loại nút bình nuôi Nút màng polyethylen chịu nhiệt Nút bông Cao su chịu nhiệt Nhựa chịu nhiệt Môi trường nuôi cấy Thành phần 1) Các muối khoáng đa lượng 3) Vitamin 2) Các muối khoáng vi lượng 5) Chất điều hoà sinh trưởng 6) Phụ gia hữu cơ ... giá thể 4) Nguồn cacbon Muối khoáng đa lượng: lớn hơn 30 mg/L N; S; P; K; Mg; Ca. Nitơ: NO3, NH4.... Lưu huỳnh: SO4. Phospho: PO4. 1) Các muối khoáng đa lượng 2) Các muối khoáng vi lượng Muối khoáng vi lượng: nhỏ hơn 30 mg/L Fe; B; Mn; Cu; Zn; Co; I: Mo. Fe: Thường dùng với NaEDTA Bo: thiếu ->Mô nuôi cấy hoá mô sẹo mạnh, mong nước, khả năng tái sinh kém; Mo: Trao đổi nitơ Vitamin nhóm B – Bổ sung vào phân thiếu hụt của tế bào B1- Thiamin hydrrocloride; B2: Riboflavin B5-panthotenic axit; Biotin: cần thiết cho phân bào. Myo-inositol: có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào 3) Vitamin Mô thực vật chủ yếu sống bằng phương pháp dị dưỡng, Có thể tổng hợp chất hữu cơ nhờ quang hợp. Thường dùng đường sucrose, có thể dùng glucose Fructose, malnose...kém hiệu quả. Manitol, sorbitol: dùng để ổn định áp suất thẩm thấu. Các nguồn carbon khác kém hiệu quả 4) Nguồn cacbon CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT (GROWTH REGULATOR) Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật 1. Auxin 2. Cytokinin 3. Giberellin 4. Ethylen Nhóm Auxin Tác dụng: Kính thích sinh trưởng, kéo dài tế bào. Kích thích sự hình thành rễ. Kém bền vững. Bị phá huỷ dưới tác động của nhiệt độ và ánh sáng. Phân loại Auxin tự nhiên: IAA Auxin tổng hợp: NAA, 2,4-D; IBA Có mặt ở hầu hết các mô thực vật, là auxin tự nhiên, được tổng hợp ở lá non, đỉnh sinh trưởng đang phát triển mạnh. Indol acetic acid (IAA) IAA có liên quan đến tất cả các quá trình hoạt động sống của thực vật. IAA cần thiết để khởi động việc tổng hợp tổng hợp ADN. Dưói tác động của IAA bầu nhuỵ phát triển thành quả IAA cần thiết cho vịêc phân hoá tế bào IAA kích thích việc hình thành rễ Làm chậm quá trình già và rụng của lá, quả IAA tạo thành trong thực vật được vận chuyển theo hướng một chiều rõ rệt từ đỉnh tới các phần dưới với vận tốc 1-17 mm/giờ; là quá trình vận chuyển tích cực. Tác dụng sinh học của IAA Vận chuyển IAA trong cây Trung tâm trội ở thực vật Tác dụng sinh học của IAA Kích thích hình thành rễ -Naphtyl acetic axid (NAA) -NAAlà auxin tổng hợp, không có trong tự nhiên Tác dụng mạnh hơn IAA Kính thích sinh trưởng, kéo dài tế bào. Kích thích sự hình thành rễ. Tăng hô hấp của tế bào Tăng khả năng hấp thụ đường. Có ba cơ chế tác dụng: lên enzym, lên gene và các enzym phân giải axit nucleic và thay đổi thẩm thấu của màng tế bào: gắn vào màng làm màng mềm ra, kéo dài ra, kích hoạt bơm proton 2,4-D là auxin tổng hợp, không có trong tự nhiên. Tác dụng: tương tự như IAA, nhưng mạnh hơn IAA. Là thuốc diệt cỏ. Ỏ nồng độ thấp có tác dụng như kích thích sinh trưởng Kính thích sinh trưởng, kéo dài tế bào. Kích thích sự hình thành rễ. Phối hợp với các cytokinin kích thích tạo thành mô sẹo 2,4 diclo phenoxy Acetic Acid (2,4-D) Indol-butiric acid (IBA) Tác dụng: Tương tự như IAA, nhưng mạnh hơn IAA, bền vững với nhiệt độ và ánh sáng. Kính thích sinh trưởng, kéo dài tế bào. Kích thích sự hình thành rễ. Trong một số trường hợp có tác dung tốt hơn IAA, 2,4 D, NAA trong việc kích thích ra rễ IBA là auxin tổng hợp, không có trong tự nhiên. Cytokinin Kinetine Kinetine- Furfuryl aminopurin: Là dẫn xuất của adenin, là cytokinin tự nhiên, tổng hợp ở phần rễ được vận chuyển lên các phần trên. Tác dụng: Kích thích phân chia tế bào Hạn chế sự già hoá của tế bào Tác dụng lên trao đổi chất Tăng cường tổng hợp ADN Tăng cường tổng hợp Protein Tăng cường hoạt động của các enzym Zeatin- Cytokinin tự nhiên. Tìm thấy trong cây với nồng độ rất thấp. Kém bền vững với nhiệt độ, ánh sáng. It được sử dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Giá thành rất cao 1500$/g. Zeatin Benzyl aminopurine (BAP - BA) Benzyl aminopurin - cytokinin tổng hợp, không có trong tự nhiên Là dẫn xuất của adenin Mạnh hơn Kinetin, bền vững với nhiệt độ cao Sử dụng rất thông dụng trong lĩnh vực công nghệ tế bào Tác dụng: tương tự kinetin Kích thích phân chia tế bào Hạn chế sự già hoá của tế bào Tác dụng lên trao đổi chất Tăng cường tổng hợp ADN Tăng cường tổng hợp Protein Tăng cường hoạt động của các enzym Tương tác giữa các Nhóm Cytokinin và auxin Trong cơ thể thực vật các auxin và cytokinin không bao giờ tác dụng riêng rẽ mà luôn luôn tác dụng phối hợp. Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát sinh, phát triển của tế bào. Tỷ lệ A/C cao – hình thành rễ Tỷ lệ A/C thấp - phân hoá chồi Tỷ lệ A/C cân bằng – Mô sẹo. Trao đổi chất của auxin ảnh hưởng đến trao đổi chất cytokinin và ngược lại Giberellin Tác dụng: Kéo dài cây, phá ngủ Có thể dùng để phá ngủ của chồi non, hạt, củ Là phytohormon tự nhiên. Trong tự nhiên tồn tại nhiều dẫn xuất. Tổng hợp ở lá non, quả, rễ. sau đó vận chuyển dến các cơ quan khác. Ethylen Là phytohormon tự nhiên, có trong nhiều loại mô thực vật Có tác dụng rất mạnh đến trao đổi chất và hoạt động sinh lý Tăng hô hấp trong thời gian quả chín Kích thích nảy mầm Kích thích kéo dài thân và rễ. Nước dừa, Bột chuối nghiền; Bột khoai tây nghiền Dich chiết cà rốt; Dịch chiết nấm men Dich thuỷ phân casein, casein hydrolysat. Các axit amin.... Phụ gia hữu cơ ... giá thể Nước dừa Được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần phức tạp, không ổn định tuỳ theo mùa, độ tuổi của cây, nguồn gốc của cây Tuy vậy có tác dụng rất tốt trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần hoá học: Kích thích sinh trưởng-kinetin, auxin, axit amin tự do, Protein, peptid, Đường, axit hữu cơ, myoinositol …. Giá thể Thạch (agar) là giá thể phổ biến Là một loại polysacharide chiết xuất từ tảo. Hoà tan ở trong 80 độ C. ở 40 độ C trở về trạng thái gel- nửa cứng Ngoài ra còn có một số chất giá thể khác như phytagel, agarose.... pH MÔI TRƯỜNG Là yếu tố cực kỳ quan trọng trong môi trường. pH ảnh hưởng đến các yếu tố sau: Sự tương tác giữa các chất, đặc biệt là trong quá trình khử trùng. Rất quan trọng đối vơi việc thuỷ phân agar. pH cao, thấp quá đều dẫn đến việc thạch không đông sau khi khử trùng. Ảnh hưởng đến các vitamin và các chất hữu cơ. Trước khử trùng: pH = 5.8 (trừ các thí nghiệm đặc biệt). Sử dụng KOH, NaOH để điều chỉnh độ pH. Trong quá trình nuôi cây pH giảm dần (môi trường chua hoá) CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White, Knop và Knudson C … Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg … Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)… Khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất, sau đó điều chỉnh các thành phần dinh dưỡng. MÔI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962) (MS) NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4 KH2PO4 Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG Môi trường đã chuẩn bị trong bình nuôi Lấy đủ lượng hoá chất và phụ gia cần thiết. Đun nóng để hoà tan thạch. Trộn hoá chất và thạch. Định mức. Chuẩn độ pH. Chia ra các bình nuôi cấy. Khử trùng. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG Lý do phải khử trùng. Các quá trình xảy ra khi khử trùng: Tương tác giữa các chất Phá huỷ một số chất Điều kiện tiêu diệt vi sinh vật. Chế độ khử trùng tối ưu. Thời gian khử trùng tối ưu Một số loại nồi khử trùng thông dụng KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG Khử trùng bằng màng lọc: Lý do phải khử trùng bằng màng lọc. Nguyên tắc khử trùng bằng màng lọc. Ưu diểm: nhanh, không thay đổi thành phần môi trường Nhược điểm: đắt, rât khó ứng dụng cho các dung dịch có độ nhớt cao... KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG Cấy mẫu Điều kiện cấy mẫu: vô trùng tuyệt đối Thao tác cấy trong tủ vô trùng Cấy mẫu Điều kiện cấy mẫu: vô trùng tuyệt đối Một loại tủ cấy vô trùng thông dụng Cấy mẫu