Khảo sát ảnh hưởng của BAP, NAA và ba dịch chiết tự nhiên đến sinh trưởng, phát triển giống Lan Ren (renanthera sp) trong nuôi cấy in-Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO Họ và tên sinh viên: PHẠM THANH HUYỀN Ngành: NÔNG HỌC Niên khóa: 2004 – 2008 Tháng 11 /2008 i KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO Tác giả PHẠM THANH HUYỀN (Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông Học) Giáo viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN CHÂU NIÊN KS. BÙI THÙY LINH Tháng 11/2008 ii LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ những người đã sinh thành và nuôi dưỡng cho con có được ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Châu Niên đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Lời cảm ơn chân thành cũng xin được gửi đến cô Bùi Thuỳ Linh - người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Di Truyền Giống của khoa Nông Học. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Nông Học trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, thân hữu đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập tại trường. Sau cùng, xin chúc quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh lời chúc sức khoẻ và thành công trong công tác đào tạo. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng 11 năm 2008 Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Huyền iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của BAP, NAA và ba dịch chiết hữu cơ đến sinh trưởng, phát triển giống lan Ren (Renanthera sp.) trong nuôi cấy in-vitro” được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di Truyền Giống, khoa Nông Học, trường ĐH Nông Lâm, thời gian thực hiện từ ngày 2/6 đến 2/10 năm 2008. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Đề tài nhằm theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của lan Ren đối với in-vitro, khi thay đổi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA, dịch chiết nước dừa, khoai tây và chuối xanh trong môi trường nuôi cấy. Kết quả đạt được: Sử dụng chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA trong nhân giống in-vitro: Hai công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và NAA thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của lan Ren nuôi cấy mô là: - Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 1,5mg/lít BAP + 0,2mg/lít NAA. - Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 0,4mg/lít NAA + 0,5mg/lít BAP Sử dụng các dịch chiết hữu cơ: Đối với các dịch chiết hữu cơ: đưa vào môi trường nuôi cấy hàm lượng dịch chiết hữu cơ thích hợp nhằm làm tăng sự sinh trưởng phát triển của hoa lan Ren. Các công thức môi trường cụ thể như sau: - Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 200ml/lít nước dừa - Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 100ml/lít dịch chiết khoai tây - Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 50ml/lít dịch chiết chuối xanh iv MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................................... ii Tóm tắt ...................................................................................................................................... iii Mục lục ...................................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................................... vii Danh sách các biểu đồ ............................................................................................................ viii Danh sách các bảng ................................................................................................................... ix Chương 1 GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2 Mục đích – yêu cầu ..................................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ............................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu ............................................................................................................... 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật ............................................................................ 3 2.1.1 Khái niệm ........................................................................................................... 3 2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................... 3 2.2 Các phương pháp nhân giống in-vitro ........................................................................ 6 2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .................................................................................. 6 2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo ................................................................................................. 7 2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn ............................................................................................ 7 2.2.4 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen ........................................................................ 8 2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội .................................................................................. 8 2.3 Các bước vi nhân giống và những hiện tượng thường gặp ......................................... 8 2.3.1 Các bước vi nhân giống ...................................................................................... 8 2.3.2 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cấy ................................................... 9 2.4 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và Việt Nam ....................................................... 9 2.4.1 Trên thế giới ....................................................................................................... 9 2.4.2 Tại Việt Nam .................................................................................................... 10 2.5 Vai trò các chất điều hoà sinh trưởng dịch chiết hữu cơ trong nuôi cấy in-vitro ..... 10 2.5.1 Auxin ................................................................................................................ 10 2.5.2 Các cytokinine .................................................................................................. 11 2.5.3 Dịch chiết xuất hữu cơ từ trái cây, củ quả ........................................................ 12 2.6 Giới thiệu về lan Renanthera sp. ............................................................................... 12 2.6.1 Nguồn gốc ......................................................................................................... 12 2.6.2 Đặc điểm thực vật học ...................................................................................... 13 2.6.3 Đặc điểm sinh thái ............................................................................................ 14 2.6.4 Kỹ thuật trồng lan Ren ...................................................................................... 14 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 16 v 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................................. 16 3.2 Phương tiện thí nghiệm ............................................................................................ 16 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm ........................................................................................ 16 3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 16 3.3 Phương pháp thí nghiệm ........................................................................................... 18 3.3.1 Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 18 3.3.2 Tiến hành thí nghiệm ........................................................................................ 18 3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................... 19 3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 20 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 21 4.1 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sinh trưởng, phát triển của lan Ren ........................................................................................................... 21 4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 5 nồng độ BAP và 2 nồng độ NAA đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro ............................................................. 21 4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của 5 nồng độ NAA và 2 nồng độ BAP đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro ............................................................. 29 4.2 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của dịch chiết hữu cơ đến sự sinh trưởng, phát triển của lan Ren ........................................................................................................................... 36 4.2.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro ............................................................................. 36 4.2.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro ............................................................. 39 4.2.3 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch chiết Chuối Xanh đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro ...................................................... 41 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 44 5.1 Kết luận ..................................................................................................................... 44 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 46 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 48 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of Variance BAP : 6 - Benzylaminopurine Ctv : Cộng tác viên ĐC : Đối chứng MS : Murashige và Skoog (1962) MTN : Môi trường nền NAA : α – napthylacetic acid NT : Nghiệm thức REN : Renanthera sp. NSC : Ngày sau cấy vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Đặc điểm thực vật học của lan Ren ......................................................................... 13 Hình 2.2: Một số giống hoa lan Ren ........................................................................................ 15 Hình 4.1: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sinh trưởng, phát triển của lan Ren ................. 28 Hình 4.2: Ảnh hưởng của NAA và BAP đến sinh trưởng và phát triển lan Ren ..................... 30 Hình 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết nước dừa đến sinh trưởng của lan Ren in-vitro ............. 38 Hình 4.4: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến sinh trưởng, phát triển lan Ren ............... 40 Hình 4.5: Ảnh hưởng của dịch chiết chuối xanh đến sinh trưởng, phát triển lan Ren ............ 43 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro ......................... 48 Biểu đồ 2: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số rễ của lan Ren in-vitro .......................... 48 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro .......... 48 Biểu đồ 4: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài lá của lan Ren in-vitro ............... 48 Biểu đồ 5: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài rễ của lan Ren in-vitro ............... 48 Biểu đồ 6: Ảnh hưởng BAP và NAA đến trọng lượng tươi của lan Ren in-vitro .................... 48 Biểu đồ 7: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro .......................... 49 Biểu đồ 8: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số rễ của lan Ren in-vitro .......................... 49 Biểu đồ 9: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro .......... 49 Biểu đồ 10: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài lá của lan Ren in-vitro ............. 49 Biểu đồ 11: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài rễ của lan Ren in-vitro ............. 49 Biểu đồ 12: Ảnh hưởng NAA và BAP đến trọng lượng tươi của lan Ren in-vitro .................. 49 Biểu đồ 13: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro ....... 50 Biểu đồ 14: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến chỉ tiêu chiều dài lá lan Ren in-vitro ......... 50 Biểu đồ 15: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến trọng lượng tươi lan Ren in-vitro .............. 50 Biểu đồ 16: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến chỉ tiêu số lá lan Ren in-vitro ..................... 50 Biểu đồ 17: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến chỉ tiêu chiều dài lá lan Ren in-vitro .......... 50 Biểu đồ 18: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến trọng lượng tươi lan Ren in-vitro ............... 50 Biểu đồ 19: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro ............ 51 Biểu đồ 20: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu chiều dài lá Ren in-vitro ............. 51 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số lá (lá/chồi) của lan Ren in-vitro ............. 22 Bảng 4.2: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài lá (mm) của lan Ren ................... 23 Bảng 4.3: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số rễ (rễ/chồi) của lan Ren in-vitro ........... 24 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chiều dài rễ (mm) lan Ren sau 90NSC ............. 25 Bảng 4.5: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều cao chồi (mm) lan Ren in-vitro ........ 26 Bảng 4.6: Ảnh hưởng BAP và NAA đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro ...................... 27 Bảng 4.7: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số lá (lá/chồi) của lan Ren in-vitro ............. 29 Bảng 4.8: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài lá (mm) lan Ren in-vitro ............. 31 Bảng 4.9: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số rễ (rễ/chồi) của lan Ren in-vitro ............ 32 Bảng 4.10: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài rễ (mm) lan Ren in-vitro ........... 33 Bảng 4.11: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro .......... 34 Bảng 4.12: Ảnh hưởng NAA và BAP đến trọng lượng tươi (g) của lan Ren in-vitro .............. 36 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nước dừa đến chỉ tiêu số lá và chiều dài lá của lan Ren ............... 37 Bảng 4.14: Ảnh hưởng nước dừa đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro ........................... 38 Bảng 4.15: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến số lá và chiều dài lá lan Ren .................. 39 Bảng 4.16: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro ........... 41 Bảng 4.17: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro ............. 42 Bảng 4.18: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến trọng lượng tươi (g) Ren in-vitro .............. 43 1 1 Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đời sống con người ngày càng phát triển, từ đó nhu cầu về vật chất và tinh thần ngày càng nâng cao. Nếp sống văn minh cùng với môi trường làm việc hiện đại hình thành cho con người tác phong công nghiệp, đòi hỏi chúng ta phải dành nhiều thời gian cho công việc, giảm bớt thời gian dành cho việc nghỉ ngơi, thư giãn. Chính vì thế mà nhiều người trong chúng ta mắc phải căn bệnh được gọi là STRESS! Do sức ép của công việc quá lớn. Nhiều nhóm nghiên cứu về Stress đã đưa ra kết quả thật bất ngờ. Đó là, chính hoa – cây kiểng là giải pháp giải quyết một cách tốt đẹp và hữu hiệu đến thần kỳ cho căn bệnh tinh thần STRESS này. Cộng với việc nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa được thiên nhiên ưu đãi, có bốn mùa trong năm thuận lợi cho sự phát triển nông nghiệp, đặc biệt là ngành trồng hoa – cây kiểng. Một ngành vừa mang lại giá trị giải trí, nghệ thuật lại vừa mang lại cả giá trị kinh tế cao. Vì thế trong những năm gần đây nghề trồng hoa – cây kiểng được chú trọng nhiều hơn. Thú chơi hoa – cây kiểng cũng xuất hiện nhiều và phổ biến hơn trong nhiều hộ gia đình. Loài hoa luôn giành được sự chú ý và quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là hoa Lan, một loài hoa với muôn màu muôn sắc và hương thơm thật hấp dẫn, còn được phong tặng danh hiệu là nữ chúa của các loài hoa. Như chúng ta đã biết hoa Lan xuất hiện với sự phong phú đến muôn hình muôn vẻ về kiểu dáng từ cấu trúc hình thể đến màu sắc. Một số thì mộc mạc giản dị, dễ trồng và phổ biến, một số khác thì lại khoác trên mình một vẻ đẹp kiêu sa đến mức được nâng niu vì sự quí hiếm của nó. 2 Một ví dụ chứng minh ở đây là giống Lan lai Ren với giá trị của nó được giới chơi hoa tính theo chiều cao. Ren là giống Lan lai còn rất quí hiếm ở Việt Nam, chưa được nhiều người biết đến. Lan Ren đã thể hiện sự vượt trội đẳng cấp của mình từ vẻ đẹp sắc sảo của hoa, lượng hoa lớn trên một phát hoa, kích cỡ khổng lồ của phát hoa đến vẻ cứng cáp bên ngoài của cây. Ren thực sự khiến người ta phải ngưỡng mộ và trầm trồ trước vẻ đẹp của chính mình. Qua đó và được sự đồng ý của bộ môn Di Truyền - Giống, ban chủ nhiệm khoa Nông Học, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tôi thực hiện đề tài “ khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy in-vitro trong nhân giống lan Ren”. 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA và dịch chiết hữu cơ thích hợp, áp dụng vào việc nhân nhanh giống lan Ren. 1.2.2 Yêu cầu Bố trí thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA, dịch chiết hữu cơ với các nồng độ khác nhau. Theo dõi các chỉ tiêu về số lá, số rễ, chiều cao cây, chiều dài lá, chiều dài rễ từ đó xác định môi trường thích hợp áp dụng cho nhân giống lan Ren in-vitro. 3 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật 2.1.1 Khái niệm Nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống in-vitro đều là thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa các môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Trong môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormones tăng trưởng và đường. 2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.2.1 Thế giới Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thế của tế bào, nhưng ông đã t