Khảo sát hệ vi khuẩn methylobacterium sp. trên lúa (oryza sativa l.) ở Tây Ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * BIỆN TUẤN AN KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN Th.S KIỀU PHƢƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * INVESTIGATING Methylobacterium sp. IN RICE (Oryza sativa L.) AT TAY NINH PROVINCE GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: Assoc.Prof.PhD. BUI VAN LE BIEN TUAN AN MSc. KIEU PHUONG NAM TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em vô cùng biết ơn PGS. TS Bùi Văn Lệ, Th.S. Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em trong suốt thời gian em học ở trường. Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt nghiệp này. Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập. Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay. Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con. Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến trường. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Biện Tuấn An v TÓM TẮT Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh”. Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS Bùi Văn Lệ Th.S Kiều Phương Nam Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon. Là vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có lợi cho thực vật và con người. Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. Được thực hiện qua các bước sau: - Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. - Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm thuần. - Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng. - Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định danh. Các kết quả đạt được: - Thu thập, phân lập và làm thuần 26 dòng vi khuẩn khác nhau thuộc chi Methylobacterium. - Khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được làm thuần và phân bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. - Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng phương pháp PCR và giải trình tự. Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các chủng so với các loài đã công bố. vi - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy PHB. Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh vật trong thời đại ngày nay. Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác. vii MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................... x Dang sách các bảng ........................................................................................................ xi Dang sách các hình-sơ đồ .............................................................................................. xii Phần I: Phần mở đầu ........................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích, yêu cầu .................................................................................................. 2 Phần II: Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 3 2.1. Cây lúa ................................................................................................................. 3 2.1.1. Nguồn gốc phân bố .......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại .......................................................................................... 4 2.1.2.1. Đặc điểm chung ........................................................................................ 4 2.1.2.2. Phân loại .................................................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn ............................................................................................................. 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ......................................................................... 7 2.2.2. Đặc điểm chung ............................................................................................. 12 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố ................................................................ 12 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ...................................................... 13 2.3. Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật ............................................................ 16 2.3.1. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ......................................... 16 2.3.2. Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật ........................................ 17 2.3.3. Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium ...................... 19 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium .................................... 21 2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật ..................................................................... 23 2.4.1. Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống ................................ 23 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................. 24 2.4.2.1. Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử ........................................................... 24 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật ....................... 26 Phần III: Vật liệu và phương pháp ................................................................................ 28 3.1. Vật liệu ................................................................................................................ 28 viii 3.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................................. 28 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................ 28 3.1.3. Hóa chất ......................................................................................................... 28 3.1.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần .......................................................... 28 3.1.3.2. Môi trường giử giống vi khuẩn .............................................................. 29 3.1.3.3. Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn .......................................................................................................... 29 3.1.3.4. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn ...................................................... 29 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR ... 29 3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 30 3.2.1. Lấy mẫu ......................................................................................................... 30 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn ........................................................................................ 31 3.2.3. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 31 3.2.4. Làm thuần ...................................................................................................... 31 3.2.5. Giữ giống ....................................................................................................... 31 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa ......................................................... 31 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào .............................................. 32 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxy ................................................................................ 33 3.2.6.3. Khả năng di động ..................................................................................... 34 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ................... 34 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR ................................. 34 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH .................................................. 37 3.2.6.7. Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn ..................................... 38 3.3. Định danh vi khuẩn ............................................................................................. 38 3.3.1. Tính hệ số tương đồng di truyền .................................................................. 38 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn ................................................................................. 38 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR ............................................................................. 39 3.3.3.1. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 39 3.3.3.2. Các primer sử dụng ................................................................................ 39 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả ........................................................................... 41 3.3.4. Giải trình tự .................................................................................................. 41 ix 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................ 41 3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ..................................... 42 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin ...................................................... 42 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB ........................................................ 42 Phần IV: Kết quả và biện luận ....................................................................................... 44 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ............................................................................ 44 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 46 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào ....................................... 46 4.2.2. Mối quan hệ với oxy ..................................................................................... 46 4.2.3. Khă năng di động ........................................................................................... 47 4.2.4. Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon ........................................... 47 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GNR .......................................................................... 49 4.2.6. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn ... 50 4.2.7. Đường cong tăng trưởng tế bào ..................................................................... 52 4.3. Kết quả định danh vi khuẩn ................................................................................ 55 4.3.1. Hệ số tương đồng di truyền ........................................................................... 55 4.3.2. Kết quả PCR .................................................................................................. 56 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium .................................. 56 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn ............................... 57 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã công bố ................................................................................................................ 58 4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp .................................. 61 4.4.1. Định tính auxin ............................................................................................... 61 4.4.2. Định tính PHB ................................................................................................ 61 Phần V: Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 62 5.1. Kết luận................................................................................................................. 62 5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 62 Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 63 Phụ luc ........................................................................................................................... 76 x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMS: môi trường MS bổ sung caseine hydrolase CP: môi trường cao thịt-peptone ctv: cộng tác viên DC: đối chứng DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one IAA: indole-3-acetic acid MMS:môi trường methanol mineral salts NCBI: National Center for Biotechnology Imformation OD: optical density PCR: polymerase chain reaction PHB: poly- -hydroxybutyrate PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA RNA: ribonucleotide rRNA: RNA ribosome tRNA: RNA vận chuyển UV: ultraviolet Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza .................................... 6 Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên ......................................... 8 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR ..................... 36 Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần ................................. 44 Bảng 4.2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................ 47 Bảng 4.3: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR .............................................. 49 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn ................ 53 Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền Jaccard.............................................................. 55 Bảng 4.6: Hệ số tương đồng của chủng TN10 với các loài đã công bố ........................ 58 Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các loài đã công bố ......................... 59 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH-SƠ ĐỒ Hình 2.1: Hình thái cây lúa .............................................................................................. 5 Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới kính hiển vi điện tử ....................................................................................... 13 Hình 2.3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB trong quá trình biến dưỡng ............................................................................ 15 Hình 2.4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp. ở cây dương nuôi cấy mô .................. 22 Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA ........................................... 40 Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi 2F và 2R .................................... 40 Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F ..................................................................................... 41 Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MMS ................................................. 45 Hình 4.2: Hình dạng tế bào trong thử nghiệm gram với vật kính 100X ....................... 46 Hình 4.3: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................. 48 Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào ............................. 50 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ............................ 50 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ................................... 51 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn .......................................................... 52 Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R ..................... 57 Hình 4.9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R Và FPGS1509 với 2F .................................................................................... 58 Hình 4.10: Cây phát sinh loài ........................................................................................ 60 Hình 4.11: Kết quả định tính auxin ............................................................................... 61 Hình 4.12: Sự bắt sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang .................... 62 1 Phần I: Phần mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Cây lúa là cây lương thực chủ yếu của các nước châu Á và Việt Nam. Cùng với sự gia tăng dân số trên toàn thế giới thì nhu cầu về lương thực nói chung và nhu cầu lúa gạo nói riêng đang ngày một tăng lên. Vì vậy, một nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải gia tăng diện tích gieo trồng và năng suất lúa. Trong đó, việc gia tăng năng suất là chủ yếu. Để gia tăng năng suất lúa thì việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, việc sử dụng hóa chất để khống chế sự phá hại của sinh vật gây bệnh cũng như để gia tăng sự phát triển của thực vật đem lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất đã và đang làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Bên cạnh đó, lượng khí methan tạo ra do canh tác lúa nước là nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính. Cho nên, kiến tạo một nền nông nghiệp bền vững là xu hướng chung hiện nay của thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này là dùng các nguyên liệu có nguồn gốc từ tự