Khảo sát sự sinh trưởng của saccharomyces sp, trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 29, Thú Y 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Vƣơng Thị Hồng Vi TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm” đƣợc tiến hành tại phòng Thực Tập Vi Sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Đề tài đƣợc thực hiện với mục đích tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối của nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. Kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc: Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Tuy nhiên, môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Và thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày sản xuất). Việc nuôi cấy chung vi khuẩn sB. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae. ABSTRACT The study on the growth of Saccharomyces sp. on rice bran medium, sugar cane molasses medium and some factors influence on their vitality power for the purpose of producing probiotic. Our topic is done from March to August, 2007 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city. S. boulardii was isolated from probiotic and S. cerevisiae was isolated from grapes. They grew well both on rice bran medium and sugar cane molasses medium. Experimental results showed S. boulardii grew better on rice bran than on sugar cane molasses medium. The best time for harvesting S. boulardii biomass was 60 hours after culturing. But, S. cerevisiae grew better on sugar cane molasses medium and the best time for harvesting their biomass was 36 hours after culturing. The rate acid ascorbic and background substance (wheat flour or rice bran) didn’t show the influence to yeast vitality. No considerable oscillations of S. cerevisiae biomass occurred in co-culture with Bacillus subtilis. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách các hình ix Danh sách các bảng x Chƣơng 1. PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích đề tài .................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu đề tài ...................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1. Đặc điểm chung của nấm men ............................................................................. 3 2.2. Vai trò của nấm men ............................................................................................ 4 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men .................................................................. 5 2.3.1. Sinh sản vô tính ......................................................................................... 5 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi .......................................... 5 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào .............................. 5 2.3.2. Sinh sản hữu tính ....................................................................................... 6 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) ................................... 6 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) ............................. 6 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men ............................................................ 7 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces ................................................................... 9 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 10 2.5.2. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 10 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men ........................................................ 11 2.6.1. Giai đoạn thích nghi ................................................................................ 11 2.6.2. Giai đoạn logarit ...................................................................................... 11 2.6.3. Giai đoạn ổn định .................................................................................... 12 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa ................................................................................. 12 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào .................................................................................... 12 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 12 2.7.2. Nhiệt độ ................................................................................................... 14 2.7.3. pH của môi trƣờng .................................................................................. 14 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn .................................................................. 14 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn .............. 15 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi .............................. 18 2.9.1. Ở nƣớc ngoài ........................................................................................... 18 2.9.2. Ở trong nƣớc ........................................................................................... 19 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .............................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 21 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 21 3.2. Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................ 21 3.2.1. Mẫu khảo sát ........................................................................................... 21 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 21 3.2.3. Hóa chất .................................................................................................. 21 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 21 3.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 22 3.4.1. Phân lập nấm men ................................................................................... 22 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì ......................................... 22 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho ............................................................................. 22 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B .......................................................................... 23 3.4.2.1. Mục đích ........................................................................................... 23 3.4.2.2. Thông số cố định .............................................................................. 23 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 23 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 23 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces ............. 24 3.4.3.1. Mục đích ........................................................................................... 24 3.4.3.2. Thông số cố định .............................................................................. 24 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 24 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 25 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm .......................... 25 3.4.4.1. Mục đích ........................................................................................... 25 3.4.4.2. Thông số cố định .............................................................................. 25 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 26 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ... 26 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .................................................................................................. 26 3.4.6.1. Mục đích ........................................................................................... 26 3.4.6.2. Thông số cố định .............................................................................. 26 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 27 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 27 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu ......... 27 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) ............ 28 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 30 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B ........................................................................................... 30 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces .................................... 33 4.2.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 33 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 35 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ................................................ 37 4.3.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 38 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm .............................. 39 4.4.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 39 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 42 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .......................................................................................................... 43 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 47 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 47 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 49 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure 31 Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 31 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii 32 Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 32 Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men 51 Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng Sabouraud 51 Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Thành phần hoá học của nấm men 17 Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men 17 Bảng 2.3: Thành phần khoáng của nấm men 18 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men 18 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 30 Bảng 4.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 33 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 34 Bảng 4.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 36 Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.10: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 43 Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 44 Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 48 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 49 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 49 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 51 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 51 Bảng ANOVA 7.1 51 Bảng ANOVA 7.2 51 Bảng ANOVA 7.3 52 Bảng ANOVA 7.4 52 Bảng ANOVA 7.5 52 Bảng ANOVA 7.6 52 Bảng ANOVA 7.7 52 Bảng ANOVA 7.8 53 Bảng ANOVA 7.9 53 Bảng ANOVA 7.10 53 Bảng ANOVA 7.11 53 1 Chƣơng 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế biến thực phẩm thì Saccharomyces đƣợc xem là một trong những ứng cử viên sáng giá nhất. Từ rất lâu, chúng đã đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm cho ngƣời nhƣ lên men rƣợu, bia, sản xuất men bánh mì, nƣớc giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã đƣợc sử dụng nhiều cho chăn nuôi nhƣ chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi. Việc nghiên cứu sản xuất ở qui mô nhỏ và vừa các chế phẩm sinh học từ nấm men giúp phòng bệnh và kích thích sinh trƣởng cho gia súc, gia cầm phù hợp với thực tiễn nƣớc ta đã và đang đƣợc triển khai nghiên cứu ứng dụng. Với xu hƣớng đó, việc nghiên cứu khả năng sinh trƣởng và phát triển giống nấm men Saccharomyces trên các loại môi trƣờng khác nhau nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là công việc quan trọng và cần thiết. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm đến thời gian thu hoạch và phƣơng pháp bảo quản khả năng sống của chúng trong chế phẩm. Sở dĩ Saccharomyces đƣợc sử dụng phổ biến để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi vì chúng thuộc loại nấm đơn bào, chứa nguồn protein phong phú, hàm lƣợng vitamin cao (đặc biệt là vitamin nhóm B) mà thời gian chúng sinh sản nhanh lại dễ nuôi cấy và thu hoạch. Đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của Ts. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài 2 “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm”. 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập các chủng nấm men từ 4 nguồn mẫu chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ và nho. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. Khảo sát, tìm hiểu thời gian thích hợp để thu hoạch nấm men. Đánh giá ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền (cám gạo, bột mì) lên sức sống của Saccharomyces sp. trong chế phẩm. Đánh giá ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhƣ trong đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt. Hìn