Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc aspergillus oryzae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ MINH SƠN KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Võ Tấn Thành Lê Minh Sơn MSSV: 2051673 Lớp: CNTP K31 Cần Thơ, 2009 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ii Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” do sinh viên Lê Minh Sơn thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Giáo viên hướng dẫn Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2009. Chủ tịch hội đồng TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iii LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập tại Trường Đại Học Cần Thơ, dưới sự chỉ dạy tận tình của các thầy cô, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn của mình đến các Thầy cô Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm. Và em sẽ luôn ghi nhớ những tình cảm cao quý đó trong hiện tại cũng như sau khi ra trường. Em xin trân trọng cảm ơn Thầy Võ Tấn Thành – giáo viên trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy luôn quan tâm, theo dõi và giúp đỡ em tận tình về kiến thức, phương pháp học tập, nghiên cứu,… Thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn Giám Đốc Công ty TNHH Phong Dinh, các anh chị phòng kỹ thuật, phòng kinh doanh, tổ cơ điện và anh chị em công nhân trong công ty đã giúp đỡ, chỉ dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này. Em xin cảm ơn thầy Lý Nguyễn Bình, trưởng Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đồng thời là cố vấn học tập của lớp Công Nghệ Thực Phẩm K31, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện luận văn và hoàn thành quá trình nghiên cứu của mình. Em xin chân thành biết ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm cùng tất cả các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm K31 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các quý thầy cô và các bạn. Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Sinh viên thực hiện Lê Minh Sơn Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iv TÓM TẮT Nhằm mục đích cải tiến quy trình sản xuất nước tương lên men truyền thống bằng phương pháp kiểm soát trực tuyến thời gian ủ mốc, nhiệt độ lên men và sử dụng mấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng trong quá trình ủ mốc, để sản xuất nước tương lên men có giá trị dinh dưỡng và chất lượng cao, không chứa độc tố aflatoxin và rút ngắn thời gian sản xuất, đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” được tiến hành. Phần nghiên cứu thí nghiệm được tiến hành với các nội dung: - Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để thể hiện hoạt lực enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc. Sử dụng hệ màu ”RGB” (red, green, blue) để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc trong thời gian ủ. - Ảnh hưởng của cơ chất (bột mì) đến sự phát triển và sản sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình ủ mốc. - Ảnh hưởng của nồng độ muối và tỉ lệ phối trộn bột mì (trong quá trình ủ mốc) đến quá trình thủy phân protein của đậu nành trong quá trình lên men. Nghiên cứu thu được một số kết quả như sau: - Có thể Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để theo dõi hoạt lực enzyme protease trong quá trình ủ mốc. Có thể sử dụng hệ màu “RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để biết được khoảng thời gian chính xác nấm mốc sinh ra nhiều enzyme nhất để kết thúc quá trình ủ nhằm rút ngắn thời gian sản xuất. - Bổ sung thêm 5% bột mì vào môi trường ủ mốc, giúp nấm mốc phát triển tốt và sản sinh ra nhiều enzyme protease thủy phân protein. - Bổ sung thêm 5% bột mì trong quá trình ủ, kết hợp với nồng độ muối 15% trong môi trường lên men đạt hiệu suất thủy phân cao nhất. - Lên men trong tủ ủ ở nhiệt độ 500C giúp làm giảm lượng đạm amoniac sinh ra. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... iii TÓM TẮT..........................................................................................................................iv MỤC LỤC...........................................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... viii Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ. ....................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..............................................................................1 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..........................................................................2 2.1 MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRONG NƯỚC....................................2 2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải.......................................................2 2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men .......................................................3 2.2 NGUYÊN LIỆU .................................................................................................4 2.2.1 Đậu nành......................................................................................................4 2.2.2 Lúa mì ..........................................................................................................6 2.2.3 Muối ăn ........................................................................................................7 2.2.4 Aspergillus oryzae........................................................................................8 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT .............9 2.3.1 Ngâm đậu .....................................................................................................9 2.3.2 Hấp đậu........................................................................................................9 2.3.3 Độ ẩm trong quá trình nuôi mốc..................................................................9 2.3.4 Nhiệt độ trong quá trình nuôi mốc...............................................................9 2.3.5 Lên men trong nước muối ..........................................................................10 2.3.6 Nhiệt độ và khuấy đảo trong quá trình lên men.........................................10 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG................................................................11 Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU....................................................................13 3.1.1 Địa điểm và thời gian.................................................................................13 3.1.2 Nguyên liệu ................................................................................................13 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vi 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ.....................................................................................13 3.1.4 Hóa chất.....................................................................................................13 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................14 3.2.1 Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành................16 3.2.2 Các chỉ tiêu cần phân tích .........................................................................17 3.2.3 Phân tích số liệu.........................................................................................17 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................18 4.1 Thí nghiệm 1: Sự thay đổi giá trị màu sắc(red, green, blue) trong quá trình ủ nấm mốc ....................................................................................................................18 4.2 Thí nghiệm 2: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn bột mì trong quá trình ủ và nồng độ muối trong quá trình thủy phân đến hàm lượng đạm amin sinh ra ........20 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................29 5.1 Kết luận.............................................................................................................29 5.2 Đề nghị ..............................................................................................................29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................30 PHỤC LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .....................................................x PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ THỐNG KÊ...................................................xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vii DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007)..2 Hình 2. Qui trình sản xuất nước tương và tương Tàu .........................................................3 Hình 3: Aspergillus oryzae...................................................................................................8 Hình 4: Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành ...........................16 Hình 5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 0% ..........................................................................................18 Hình 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 5% ..........................................................................................19 Hình 7: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 10% .........................................................................................19 Hình 8: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 0% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men...............................................................22 Hình 9: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 0% .............................................22 Hình 10: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 5% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men ......................................................23 Hình 11: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 5% .............................................24 Hình 12: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 10% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men ......................................................25 Hình 13: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 10% ...........................................25 Hình 14: Đồ thị so sánh hàm lượng đạm amin sinh ra theo thời gian lên men giữa các mẫu tốt nhất ở 0%, 5% và 10% bột mì bổ sung.........................................................................26 Hình 15: Sự thay đổi hàm lượng ammoniac theo hàm lượng bột mì bổ sung ...................28 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần hoá học chính của đậu nành (% căn bản khô) ....................................5 Bảng 2. Thành phần acid amin tối cần thiết của đậu nành và thành phần acid amin chất lượng chuẩn của FAO (g/16g protein) .................................................................................5 Bảng 3. Thành phần hoá học của bột lúa mì........................................................................7 Bảng 4: Thể hiện sự tương tác giữa hai nhân tố nồng độ muối (A)và tỉ lệ bột mì (B)......15 Bảng 5: Hàm lượng đạm amin ( gN/l) theo thời gian (ngày)............................................21 Bảng 6: Hàm lượng đạm amoniac ( gN/l) theo thời gian (ngày) ......................................27 Bảng 7: Sự thay đổi màu sắc của nấm mốc và đậu nành trong quá trình ủ ở những hàm lượng bột mì bổ sung khác nhau theo thời gian ủ .............................................................xiv Bảng 8: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 0% bột mì theo nồng độ muối ...xx Bảng 9 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin..........................................................................................................xx Bảng 10: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 5% bột mì theo nồng độ muối .xxi Bảng 11 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin.........................................................................................................xxi Bảng 12: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 10 % bột mì theo nồng độ muối ..........................................................................................................................................xxii Bảng 13: kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin........................................................................................................xxii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ. Thực phẩm lên men truyền thống là loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang bản sắc riêng của từng dân tộc. Công nghệ sản xuất các sản phẩm truyền thống được thực hiện từ rất lâu và được truyền từ đời này sang đời khác. Tương và nước tương là sản phẩm tiêu biểu của các sản phẩm lên men truyền thống được chế biến từ đậu nành. Đặc biệt là nước tương, một loại nước chấm thường được sử dụng trong bữa ăn của người Việt Nam. Nước tương không chỉ có tác dụng giúp hương vị món ăn thêm đậm đà mà còn thể hiện một nét riêng, đặc trưng của ẩm thực Việt Nam. Thế nhưng, tình hình sản xuất nước tương ở nước ta hiện nay còn khó kiểm soát chất lượng. Đa số các cơ sở sản xuất tương đều sản xuất theo phương pháp cổ truyền hoặc phương pháp hoá giải. Sản xuất theo phương pháp cổ truyền thì phụ thuộc rất lớn vào thiên nhiên nên thời gian lên men kéo dài, năng suất thấp, chất lượng tương không ổn định, thay đổi theo thời tiết và vùng sản xuất, sản phẩm tương không đồng nhất và dễ bị hư hỏng do nhiễm các tạp khuẩn gây thối,… Đôi lúc nhiễm cả nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản phẩm gây ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Ngược lại, nếu sản xuất theo phương pháp hoá giải thì chi phí sản xuất cao, thiết bị ăn mòn sinh ra các chất phụ độc hại và chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, …là các chất gây ung thư. Hiện nay, vài quy trình chế biến nước tương sạch đã được nghiên cứu và công bố (Viện Sinh học nhiệt đới, Tp. Hồ Chí Minh, 2007) với hàm lượng 3-MCPD có thể chấp nhận trong sản phẩm. Thế nhưng, các quy trình đó cũng chỉ khảo sát tiến trình và các điều kiện tối ưu để sản xuất trong qui mô nhỏ, chưa có nghiên cứu kiểm soát tiến trình triệt để ở qui mô thí điểm để có thể phát triển thành sản xuất lớn. Vì vậy, cần phải có nghiên cứu để đưa ra một quy trình sản xuất nước tương có kiểm soát tiến trình để áp dụng vào sản xuất lớn. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy mốc Aspergillus oryzae và thời gian để mốc sản sinh nhiều enzyme protease (có quan sát tiến trình). Sử dụng mốc Aspergillus oryzae thuần chủng có hoạt tính cao để thủy phân protein từ đậu nành đạt hiệu quả cao, đồng thời rút ngắn thời gian ủ mốc và thời gian lên men. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRONG NƯỚC Ở nước ta nước tương thông thường được sản xuất theo hai phương pháp chính là phương pháp hóa giải và phương pháp lên men truyền thống . 2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải Trước đây, các sản phẩm nước tương trên thị trường Việt Nam chủ yếu được sản xuất theo phương pháp thuỷ phân bằng acid HCl đậm đặc tạo ra sản phẩm phụ độc hại là 3-MCPD, nước tương sản xuất bằng qui trình này có mùi vị rất ngọt, thơm, hậu ngọt hơi chua và phù hợp với hương vị người tiêu dùng, thường được gọi với tên khác là “tàu vị yểu”. Qui trình công nghệ theo sơ đồ sau: Hình 1. Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007) Phương pháp này có ưu điểm là rẻ, nhanh, hiệu suất thủy phân cao từ 85 ÷ 90%, sản phẩm giàu acid amin và dễ bảo quản. Nhược điểm chính của phương pháp acid là chi phí năng lượng và thiết bị cao do phải đáp ứng điều kiện phản ứng nhiệt độ cao và ăn mòn mạnh, chi phí xử lý sau sản xuất cao, các chất thiết yếu bị phân hủy Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 3 một phần hay hoàn toàn, sinh ra nhiều hợp chất phụ độc hại, đặc biệt là 3-MCPD và các chất đồng đẳng của chúng,…(Trần Bích Lam, 2007). 2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men 2.1.2.1 Qui trình sản xuất nước tương truyền thống Tương và nước tương là hai sản phẩm lên men với nguyên liệu chính là đậu nành. Qui trình sản xuất tương và nước tương thường giống nhau, nhưng trong qui trình sản xuất nước tương sẽ thêm một công đoạn ép lấy nước tương và loại bỏ bã. Trong qui trình sản xuất tương sẽ không áp dụng công đoạn ép, lọc. Ở Việt Nam có hai loại tương: tương Tàu và tương Ta được sản xuất theo hai qui trình có một vài điểm khác biệt, trong đó người ta dùng bột gạo hoặc bột mì để làm cơ chất giúp vi sinh vật phát triển. Đậu nành (5 kg) Bột gạo (1 kg) Vo đãi, ngâm nước qua đêm Rang Đãi sạch, hấp mềm nhừ Rây mịn Trộn đều Ủ với lá nhãn, đậy kín Sau 72 ÷ 76 giờ hạt đậu bóp ra màu nâu và cứng 1 kg muối đun sôi trong 10 lít nước, để nguội Cho vào lu hay bể chứa Ban ngày phơi nắng, đêm đậy kín Đảo khuấy ngày/lần trong 1 tháng Ép Nước tương Đem lu vào nhà, bảo quản nơi khô mát Lọc, vào chai Tương thành phẩm Thành phẩm Hình 2. Qui trình sản xuất nước tương và tương Tàu (Trần Phước Đường, 2004) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 4 Các qui trình sản xuất thủ công thường không ổn định do việc sử dụng nguồn nấm mốc có trong tự nhiên. Bên cạnh sản lượng thành phẩm không ổn định do không thể khống chế được số lượng bào tử và lượng enzyme sinh ra không đủ hoạt lực,… Ngoài ra việc sử dụng nguồn nấm mốc có trong tự nhiên còn có khả năng nhiễm các loại nấm mốc khác như Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản phẩm là nguyên nhân gây bệnh ung thư (Võ Thị Hạnh et al., 2007; Nguyễn Đức Lượng, 2003). Ở nước