Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn pseudomonas aeruginosa trong nước uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** 000 ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas aeruginosa TRONG NƢỚC UỐNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG THU TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** 000 ****** KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas aeruginosa TRONG NƢỚC UỐNG Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. PHẨM MINH THU NGUYỄN HOÀNG THU TRANG TS. NGUYỄN TRỌNG HIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ****** 000 ****** SERVEY OF THE MICROBIOLOGICAL QUALITY AND ANTIBIOTIC - RESISTANCE OF Pseudomonas aeruginosa ISOLATED FROM DRINKING WATER GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student MSc. PHAM MINH THU NGUYEN HOANG THU TRANG PhD. NGUYEN TRONG HIEP TERM: 2003 - 2007 HCMC, 08/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt bốn năm qua. Ban Giám đốc Viện PASTEUR TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: ThS. Phẩm Minh Thu, Trưởng phòng Vi Sinh Thực Phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP. HCM đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. TS. Nguyễn Trọng Hiệp, Bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM là người thầy khơi dậy trong tôi niềm đam mê trong công việc. Thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Ngọc Hải, Đại Học Nông Lâm TP. HCM đã đóng góp những ý kiến chân thành cho tôi trong bước đầu thực hiện khóa luận. Các cô trong Phòng vi sinh thực phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP. HCM đã nhiệt tình chỉ dẫn cho tôi trong quá trình thực tập.  Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn ở bên tôi, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.  Con thành kính ghi ơn ba mẹ và tất cả những người thân trong gia đình luôn là nguồn động viên và khích lệ to lớn cho con trong suốt thời gian học tập. Sinh viên Nguyễn Hoàng Thu Trang iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN HOÀNG THU TRANG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh “Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống” thực hiện tại Phòng vi sinh thực phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP HCM từ 03/2007 đến 07/02007. GVHD: ThS. PHẨM MINH THU TS. NGUYỄN TRỌNG HIỆP Vật liệu dùng để nghiên cứu là nước uống được phân thành 2 nhóm: nhóm 1 là nước uống đóng chai (50 mẫu), nhóm 2 là nước uống xử lý (350 mẫu) gồm có nước uống công ty (200 mẫu), gia đình (50 mẫu), trường học (50 mẫu), bệnh viện (50 mẫu). Chúng tôi sử dụng phương pháp màng lọc để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong nước uống dựa theo TCVN 6096:2004, làm kháng sinh đồ để kiểm tra tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo tiêu chuẩn NCCLS 2007 và tham khảo thêm tiêu chuẩn CA-SFM 2004. Kết quả chúng tôi ghi nhận được như sau: Về các chỉ tiêu vi sinh Nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất chiếm 52% mẫu kiểm tra. Tiếp theo là nước uống công ty 28%, nước uống đóng chai 20% , nước uống trường học 6% và hầu hết nước uống bệnh viện đều đạt chỉ tiêu vi sinh. Trong các chỉ tiêu vi sinh, P. aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm nhiều nhất chiếm đến 62% (59 trong 95 mẫu không đạt chỉ tiêu vi sinh), kế đến là Coliform 56%, Coliform fecal 43%, vi khuẩn kỵ khí sinh H2S 21% và Streptococcus fecalis 13%. Về tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa Trong 16 loại kháng sinh thử nghiệm, vi khuẩn đề kháng tỉ lệ cao với fosfomycin từ 33% đến 50% các chủng thu được. Một số kháng sinh khác như ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin cũng bị kháng với tỉ lệ thấp (≤ 5%). Ngoài ra, các chủng vi khuẩn tìm thấy không có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. v SUMMARY This is Nguyen Hoang Thu Trang studying at Nong Lam University and finishing the thesis in August 2007. The thesis entitles “Survey of the microbiological quality and antibiotic-resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from drinking water”. A total of 400 samples of drinking water are divided into 2 groups (drinking bottled water and drinking treated water). Group one consists of 50 samples of bottled water; group two consists of 200 samples of drinking water from companies, 50 from families, 50 from schools, 50 from hopitals. We use the TCVN 6096:2004 membrane filtration method to isolate microbiology in samples of drinking water. We also use the NCCLS 2007 and CA-SFM 2004 diffusion disk method to test the antibiotic susceptibility of P. aeruginosa isolated from samples above. The results of this research are as follows: Microbiology standards: Family drinking water which is affected most by microbiology contaminations occupies 52% of 50 samples,water from companies occupies 28% of 200 samples, bottled water occupies 20% of 50 samples, water from school only occupies 6% of 50 samples and 100% of samples from hopital is not affected by microbiology contaminations. According to microbiology standards, P. aeruginosa is found to be contaminated most, occupying 62% of 95 samples which do not meet the microbiology standards, next is Coliform 56%, Coliform fecal 43%, the spores of sulfite-reducing anaerobes (Clostidium) 21% and Streptococcus fecalis 13%. Antibiotic-resistance of P. aeruginosa: High resistance level to fosfomycin observed occupies from 33% to 50% of the isolated samples. The strains show resistance at low levels (≤ 5%) to ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin. Overall of P. aeruginosa strains isolated from drinking water are not multiresistant. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ...................................................................................... iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. viii DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ................................................ ix Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu ................................................................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu chung ................................................................................ 2 1.2.2. Mục tiêu chuyên biệt ....................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ....................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống ....................................................... 3 2.1.1. Trong nước ...................................................................................... 3 2.1.2. Thế giới ........................................................................................... 4 2.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa .................................... 5 2.2.1. Trong nước ...................................................................................... 5 2.2.2. Thế giới ........................................................................................... 6 2.3. Tổng quan các vi sinh vật. ..................................................................... 8 2.3.1. Coliforms và Coliform fecal ............................................................ 8 2.3.2. Liên cầu khuẩn nguồn gốc từ phân (Streptococcus fecalis) ............ 9 2.3.3. Vi khuẩn kỵ khí khử sunphite (Clostridium) ................................ 10 2.3.4. Pseudomonas aeruginosa .............................................................. 13 2.4. Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn .................................... 16 2.4.1. Thuốc kháng sinh .......................................................................... 16 2.4.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ........................................... 18 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 20 vii 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .......................................................... 20 3.2. Vật liệu ................................................................................................ 20 3.3. Thiết bị, hóa chất và môi trường ......................................................... 20 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 20 3.3.2. Hóa chất ......................................................................................... 21 3.3.3. Môi trường ..................................................................................... 21 3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 23 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................... 23 3.4.2. Xử lý số liệu .................................................................................. 23 3.4.3. Đánh giá kết quả ............................................................................ 24 3.4.4. Phương pháp thử nghiệm vi sinh vật ............................................. 25 3.4.5. Phương pháp làm kháng sinh đồ ................................................... 32 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 36 4.1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nước uống .......................................... 36 4.1.1. So sánh giữa 2 nhóm nước uống (đóng chai và xử lý) .................. 36 4.1.2. Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nước ....................................... 38 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nước uống ..................... 40 4.2. Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống ..................................................................................................... 41 4.3. Một số hình ảnh các vi sinh vật trong quá trình thử nghiệm............... 44 4.3.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống ............................................... 48 4.3.2. Tính đề kháng kháng sinh của P . aeruginosa .............................. 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 52 5.1. Kết luận ............................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ................................................................................................ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 54 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg microgam cm centimet g gam ml mililit mm milimet nm nanomet BEA Bile Esculine Agar BHI Brain Heart Infusion CA-SFM Comité de L’Antibiogramme de la Societe Francaise de Microbiologie. (Hội đồng kháng sinh - Hiệp hội vi sinh của Pháp) CN Cetrimide Agar DNA Deoxyribonucleic Acid ICU Intensive Care Unit ISO International Standard Orgnazation LAM Laboratory Analysis Medicine MH Mueller Hinton MT Môi Trường NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) RNA Ribonucleic Acid TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam TP. HCM Thành Phố Hồ Chí Minh TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride UV Ultra Violet ix DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ ..................................... 33 Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước ................ 36 Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước .................. 37 Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống đóng chai theo từng chỉ tiêu .............. 38 Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống công ty theo từng chỉ tiêu .................. 38 Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống gia đình theo từng chỉ tiêu ................. 39 Bảng 4-6: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống trường học theo từng chỉ tiêu ............ 39 Bảng 4-7: Tỉ lệ nhiễm P.aeruginosa giữa các loại nước uống ................................. 40 Bảng 4-8: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P . aeruginosa trong các loại nước uống ..... 41 Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước ......................................... 36 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước ....................... 37 Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước ....................... 37 Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nước uống............................. 40 Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống đóng chai ............................................................................................. 42 Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống công ty ... 42 Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống gia đình .. 43 Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E. coli giả định ................................................................................. 26 Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis ................ 28 Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) ............... 29 Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa .............................................. 31 x Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng ............................................. 22 Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh ................. 22 Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí ............................................................................................. 22 Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm ....................................................................... 32 Hình 4.1: Khuẩn lạc coliform trên môi trường lactose TTC tergitol 7 ..................... 44 Hình 4.2: Thử nghiệm khả năng lên men đường lactose của coliform, faecal coliform .......................................................................................... 44 Hình 4.3: Khuẩn lạc Streptococcus fecalis trên môi trường Slanetz và Bartley ....... 45 Hình 4.4: Khuẩn lạc Steptococcus fecalis trên thạch mật asculin-nitrua .................. 45 Hình 4.5: Khuẩn lạc các bào tử Clostridium trên thạch sunphit triptoza .................. 46 Hình 4.6: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường thạch CN ................................ 46 Hình 4.7: P. aeruginosa trên môi trường King’s B ................................................. 47 Hình 4.8: Thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn P. aeruginosa ................................. 47 1 Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nước là một thành phần quan trọng của cơ thể sinh vật nói chung trong đó có con người. Cơ thể chúng ta có đến 60 – 80% là nước. Chỉ cần mất 10% số lượng nước (khoảng 3,5 lít đối với một người nặng 50kg) là cơ thể đã có nguy cơ đưa đến tử vong. Trong điều kiện bình thường, mỗi ngày một người lớn trung bình cần khoảng 2 – 2,5 lít nước và nhu cầu này thay đổi tùy theo nhiệt độ môi trường, mức độ hoạt động thể lực, tình trạng bệnh lý của cơ thể...Loại nước cơ thể thường dùng nhất là nước lọc, nước nấu chín. Đời sống công nghiệp ngày càng phát triển nên nhu cầu sử dụng nước đóng chai rất lớn. Do đó trên thị trường xuất hiện các mặt hàng nước khoáng, nước tinh khiết đóng chai, đóng thùng lớn đang ngày càng trở nên phổ biến và thông dụng, đa dạng mẫu mã và rất nhiều chủng loại khác nhau, vì thế chất lượng cũng khó mà kiểm soát. Chính vì vậy vấn đề vệ sinh an toàn về nước uống ngày càng được chú trọng. Nước uống không đạt tiêu chuẩn vi sinh không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng mà còn là tác nhân truyền các bệnh nhiễm khuẩn qua đường ăn uống một cách nhanh chóng trên diện rộng [38]. Theo TCVN 6096 : 2004 về nước uống yêu cầu kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật bao gồm: Coliforms tổng số, Coliform fecal, Streptococcus fecalis, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn kỵ khí khử sunphite [1]. Trong đó, P. aeruginosa là một chỉ tiêu mới được đưa vào. Ngày nay, người ta càng quan tâm nhiều hơn về sự xuất hiện của P. aeruginosa trong nước uống vì nó có vai trò quan trọng trong nhiễm trùng cơ hội và hiện diện phổ biến trong tự nhiên. Do đó, P. aeruginosa là một trong 3 tác nhân hàng đầu gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện [38]. Thêm vào đó, trong những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, thiếu dinh dưỡng , chúng vẫn có thể sinh sôi và phát triển tốt. 2 Trước đây, P. aeruginosa được biết đến với vai trò gây bệnh trong bệnh phẩm nhiều hơn thực phẩm, nó được xem là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, tác động đến người có sức đề kháng kém. Hiện nay, vi khuẩn này chiếm một tỉ lệ không nhỏ trên các bệnh nhiễm trùng đường tiểu, máu, phổi, vết thương,… và tỉ lệ tử vong khá cao, có thể lên đến 50% so với các loại vi khuẩn khác [23]. Gần đây, nhiều khảo sát cho thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày một gia tăng. P. aeruginosa đã đề kháng cao với các kháng sinh thường dùng ở Việt Nam [5]. Tuy nhiên, ở nước ta tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này trên nước uống chưa được khảo sát. Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống”. 1.2. Mục tiêu 1.2.1. Mục tiêu chung Đánh giá tình hình vệ sinh nước uống và tìm hiểu khả năng đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa. 1.2.2. Mục tiêu chuyên biệt  Xác định tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống theo TCVN 6096: 2004. Coliforms tổng số Coliform fecal Streptococcus fecalis P. aeruginosa Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit (Clostridium)  Xác định tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các mẫu khảo sát.  Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa tìm được. 1.3. Giới hạn đề tài Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ thực hiện kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của nước uống đóng chai và nước xử lý dùng để uống theo tiêu chuẩn nước uống đóng chai. Trong đó, đặc biệt lưu ý đến chỉ tiêu P. aeruginosa và làm kháng sinh đồ của vi khuẩn này, bởi vì đây là một loại vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng cơ hội nguy hiểm và mới được đưa vào Tiêu Chuẩn Việt Nam về nước uống đóng chai từ năm 2004 đến nay. 3 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nhiễm khuẩn nƣớc uống 2.1.1. Trong nƣớc Theo kết quả kiểm tra 152 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai quy mô nhỏ trên địa bàn TP. HCM của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố (2004), chỉ có 4 cơ sở (2,5%) đảm bảo điều kiện vệ sinh. Trong số các cơ sở còn lại, 70% cơ sở rửa bình (loại bình tái sử dụng) bằng phương pháp thủ công k