Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền cây đưng (rhizophora mucronata lamk.) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********************** BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi nấng con thành ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình về tất cả. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy, Cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Thầy TS. Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các bạn cùng thực hiện đề tài đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt cảm ơn tất cả các bạn cùng phòng đã ủng hộ tinh thần và đồng hành với tôi trong suốt thời gian học tập. Chúc mọi ngƣời đều hạnh phúc và thành đạt. Xin chân thành cảm ơn! Trƣơng Thị Minh Thùy iii TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 9/2007. “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Khóa luận đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ 7 / 5 / 2007 đến 31 / 8 / 2007. Rừng ngập mặn là hệ sinh thái gồm nhiều loài cây khác nhau, trong đó có Đƣng Rhizophora mucronata Lamk., một loài chiếm số lƣợng lớn ở vùng nƣớc mặn, đồng thời quần thể Đƣng cũng là hàng rào bảo vệ bờ biển các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy ý nghĩa kinh tế và môi trƣờng của rừng ngập mặn ngày càng đƣợc công nhận, song diện tích của chúng trên khắp thế giới đang giảm dần theo thời gian do ô nhiễm và nạn phá rừng. Trên cơ sở đó, cần có những kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh thái, thiết lập sự phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung và khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng. Khóa luận này nhằm mục đích thiết lập quy trình thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền cây Đƣng Rhizophora mucronata tại rừng ngập mặn Cần Giờ. Kết quả đạt đƣợc:  Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đƣng tƣơi.  Xây dựng đƣợc quy trình phản ứng RAPD đối với cây Đƣng. Xác định đƣợc OPAC10 là mồi tạo độ đa hình cao nhất trong số những mồi tiến hành khảo sát. Từ 14 mẫu, OPAC10 đã khuếch đại 18 locus, trong đó có 2 band đồng hình (trọng lƣợng phân tử: 300 bp và 400 bp) và 13 band đa hình.  Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền giữa các cá thể trong quần thể Đƣng tự nhiên và Đƣng đƣợc trồng biến thiên từ 46 đến 79 %. Kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, chúng tôi nhận thấy hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 %. Điều này cho thấy giữa các cá thể trong iv quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần, tuy nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp các tiểu khu vì vậy giữa các cá thể vẫn thể hiện đƣợc tính đa dạng sinh học cao. Tp. HCM, ngày 7 tháng 9 năm 2007. Trƣơng Thị Minh Thùy v ABSTRACT TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007. “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”. The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007. Supervisor: BUI MINH TRI, PhD. Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast. Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest. The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R. mucronata.  Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another vi analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100%. The result also suggested that R. mucronata at Can Gio biosphere reserve area have not had closed relation but scattered in to various groups. vii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii Tóm tắt .............................................................................................................................. iv Abstract ............................................................................................................................. vi Mục lục ............................................................................................................................. viii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xii Danh sách các bảng .......................................................................................................... xiii Danh sách các hình ........................................................................................................... xiv Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ..................................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................... 2 1.4. Giới hạn của đề tài ..................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh ....................................................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển ..................................... 3 2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4 2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên ..................................................................................... 4 2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh .............................. 6 2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ ................................................... 7 2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay ........................................ 8 2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) ........................................................... 9 viii 2.2.1. Phân loại ............................................................................................................. 9 2.2.2. Hình thái học .................................................................................................... 10 2.2.3. Phân bố ............................................................................................................. 11 2.2.4. Giá trị kinh tế ................................................................................................... 11 2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid) ............................................................................... 12 2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật .................................................................... 13 2.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA ............................................. 14 2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ ................................ 14 2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................... 15 2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) ........................................................ 16 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn ............................................................................... 16 2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn ................................................. 16 2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA ............................ 16 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................................... 18 2.5.1. Khái niệm ......................................................................................................... 18 2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 18 2.5.3. Quy trình phản ứng PCR ................................................................................ 19 2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng ......................... 20 2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) .............................................................. 21 2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ............................................. 21 2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ... 22 2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) .............. 22 2.9.1.1. Khái niệm ................................................................................................. 22 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP ...................... 23 2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) ............... 24 2.9.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 24 2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP ...................... 26 2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 27 2.9.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 27 ix 2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD ..................................................... 29 2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD ...................................................... 29 2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD ..................... 29 2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ............................................................................. 30 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .............................. 31 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 31 3.1.1. Thời gian thực hiện ......................................................................................... 31 3.1.2. Địa điểm thực hiện .......................................................................................... 31 3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 31 3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu ................................................................................ 31 3.2.2. Cách ký hiệu mẫu ............................................................................................ 31 3.2.3. Cách lấy mẫu .................................................................................................... 32 3.2.4. Cách bảo quản mẫu ......................................................................................... 32 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.3.1. Quy trình ly trích DNA ................................................................................... 32 3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA .......................................................... 32 3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA ........................................................................... 33 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......... 35 3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose .......................................................................... 35 3.3.2. Kỹ thuật RAPD ................................................................................................ 35 3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD ..................................................................... 35 3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm .............................................................................. 37 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 42 4.1. Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................... 42 4.2. Bảo quản mẫu .......................................................................................................... 43 4.3. Kết quả OD (Optical Density) ............................................................................... 44 x 4.4. Kết quả điện di ......................................................................................................... 45 4.4.1. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 ............................ 45 4.4.2. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 ............................ 45 4.4.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 ............................ 47 4.5. Kết quả phản ứng RAPD ........................................................................................ 49 4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10 ................................................................. 49 4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác . 50 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 .............................................................. 53 4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn .......................................... 53 4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD ................................................ 56 4.6. Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS .............................................. 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 61 5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 61 5.2. Đề nghị ...................................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 63 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism. bp : Base pair. DNA : Deoxyribonucleic Acid. dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate. EB : Extraction Buffer. EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetic Acid. GPS : Global Position System. MAB : Man and Biosphere. OD : Optical Density. PCR : Polymerase Chain Reaction. RAPD : Random Amplified Polymorphism of DNA. RE : Restriction Enzyme. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. RNA : Ribonucleic Acid. Rnase : Ribonuclease. SSCP : Single – strand Conformation Polymorphism. SSR : Simple Sequence Repeat. STS : Sequence – tagged Sites. Ta : Annealing temperature. TAE : Tris Glacial Acetic Acid EDTA. TE : Tris EDTA. Tm : Melting temperature. UNESCO : United Nations Educational Scientific and Cultural Organization. UV : Ultra Violet. WWF : World Wildlife Fund. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ........................................................................ 30 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 .. 37 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 ................................ 37 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 .. 38 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 ................................ 38 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 .. 39 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 ................................ 39 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 .. 40 Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 ................................ 40 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................... 5 Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng .................................. 10 Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid ........... 12 Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn .................................................................... 17 Hình 2.5 Phản ứng PCR ......................................................................................... 20 Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm ............................................... 23 Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP ....................................................................... 25 Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD ...............................................