Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng (avicenni alba) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ. Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay. Em xin gởi lòng biết ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng kỹ thuật. đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này. Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới. Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con ngƣời, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lƣợc tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái. Những kết quả đạt đƣợc:  Thu đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.  Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.  Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thƣớc 200bp.  Kết quả thực hiện phản ứng RAPD đƣợc xử lý trên mần mềm NTSYS thu đƣợc cây phân loài của những cây đem phân tích. Cây phân loài cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới. v SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD”. This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007. Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem. The obtained results were:  Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.  The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.  The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).  A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in 14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ......................................................................................... iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... xi Phần 1. GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Giới hạn của đề tài ............................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ...................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên ............................................................................................ 3 2.1.2. Cấu trúc ............................................................................................................ 6 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................... 7 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển .................................................................... 9 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................... 9 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) ................................................. 10 2.2.1. Vùng phân bố ................................................................................................. 10 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng ......................................................................... 11 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng .................................................................. 13 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ ....................... 13 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng .............................................. 14 vii 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền ......................................................................... 14 2.3.1. Đa dạng sinh học ............................................................................................ 14 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học .......................................... 14 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................ 15 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái ..................................................................................... 15 2.3.3.2. Đa dạng loài ................................................................................................. 15 2.3.3.3. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam ........................................................ 17 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật ............................................................. 18 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 19 2.5.1 Khái niệm ........................................................................................................ 19 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR .............................. 19 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 20 2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR .......................................................................... 21 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................. 21 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền .................... 22 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .............................................. 22 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR ........................................................................................ 23 2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ............................... 23 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) .......................................... 24 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 25 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................................ 30 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................................... 33 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................... 33 3.1.1. Thời gian tiến hành ......................................................................................... 33 3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33 3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 33 3.2.1. Mẫu thực vật.................................................................................................... 33 viii 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 34 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA ............................................................... 34 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA ............................................................. 35 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD .............................................. 36 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 36 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 37 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích ........................................................................ 39 3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel ...................... 39 3.3.2.2. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế ............................................ 39 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD ............................................................................... 40 3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 ..................................... 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 43 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ............... 43 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu ........................................................................ 44 4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số ............................................................. 44 4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD .................................................... 47 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 ....................................................................................... 47 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................................... 50 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ .......................................................................................................... 50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 54 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 54 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ................... 40 Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 40 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ................ 41 Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 ............................................................ 47 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 5 Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. ................................. 11 Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. ......................................................................... 12 Hình 2.4. Trái mắm trắng. ......................................................................................... 12 Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. ..................................................... 20 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI .................................................... 26 Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. ...................................... 26 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. .......................... 27 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. ................................. 28 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP ................................................... 29 Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR ........................ 30 Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ ......................... 43 Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 ........................................ 45 Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. .............................................................. 45 Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu ....................................................... 46 Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 ............................................................... 46 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 48 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 48 Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) .............................................................................................. 49 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng ............................... 50 Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng ....................................... 51 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích ......................... 52 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µl: microlite  µM: micromol/lite  bp: base pair  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate  Kb: kilobases  mM: milimol/lite  m: mét  nm: nanomét  OD: Optical density.  PCR: Polymerase chain reaction  pmol: picomol  RNA: Ribonucleic acid  Rnase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của enzyme 1 Phần 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển trên Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lƣu quốc tế. Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ. Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ. Quần thể mắm trắng tại đây chủ yếu là phát triển tự nhiên. Tuy nhiên, qua thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trƣớc sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng. Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di