Khóa luận Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững chắc cho em trong cuộc sống sau này. Để có đƣợc những thành công bƣớc đầu nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ba má là những ngƣời đã có công sinh thành, dƣỡng dục và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học. Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ƣu tú, rất tận tụy trong công tác, là ngƣời đã vạch ra hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng đƣợc tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản. Thầy Nguyễn Văn Út là ngƣời rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho em làm cơ sở áp dụng trong đề tài. Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài. Hai anh Khƣu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ Khánh Hƣng là những ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ, cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những ngƣời đã giúp đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống. Sinh viên Trƣơng Thị Hoàng Diệu iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU. Lớp DH03SH, Khóa 2003-2007, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tên đề tài: “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Kỹ sƣ NGUYỄN VĂN ÚT Thời gian tiến hành đề tài: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ sinh học sinh sản. Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó cũng là một loài đáng đƣợc lƣu tâm. Trong đề tài có 3 thí nghiệm đƣợc tiến hành: Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert- TALP và TYH Kết quả: Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM là 4,88%, 100 µM là 1,65% và đối chứng (0 µM ) là 1,3%. Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ các giai đoạn là 21,64% với nồng độ orcein là 0,75% và 28,19% với nồng độ 1%. Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trƣờng Fert- TALP là 0,4%, trên môi trƣờng TYH là 0%. v SUMMARY TRUONG THI HOANG DIEU. Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology Department of Nong Lam University. Advisor: Prof: TRAN THI DAN Engineer: NGUYEN VAN UT Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”. Period: from the 1 st Match, 2007 to the 15 th August, 2007. Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University. In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive biotechnology. Embryos are used for stem cell technology, animal breeding, conservation of valuable mammalian species,… including dog. The thesis consists of three experiments: To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on mature oocyte rate. To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result. To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro fertilization result. The results: Mature oocyte rate was 1,3% in control; 4,88% in 50 µM β-mercaptoethanol; 1,65% in 100 µM β-mercaptoethanol. Defined oocyte rate was 21,64% in 0,75% orcein; 28,19% in 1% orcein. Fertilized oocyte rate was 0,4% in Fert-TALP medium and 0% in TYH medium. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................... vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... x Danh mục các hình và biểu đồ .................................................................................. xi Danh mục các bảng .................................................................................................. xii Chƣơng 1 : MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ......................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu ........................................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1 Buồng trứng .................................................................................................... 3 2.1.1 Vị trí, hình thái ...................................................................................... 3 2.1.2 Cấu tạo................................................................................................... 3 2.1.3 Chức năng ............................................................................................. 3 2.2 Nang noãn ........................................................................................................ 4 2.2.1 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4 2.2.2 Sự phát triển của nang noãn .................................................................. 4 2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng ...................................................................... 6 2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn ............................................................. 7 2.2.4.1 Trƣởng thành nhân ...................................................................... 7 2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất ............................................................ 8 2.2.5 Sự rụng trứng ........................................................................................ 9 2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) .................... 9 2.3.1 Lịch sử IVM .......................................................................................... 9 2.3.2 Môi trƣờng IVM .................................................................................. 10 vii 2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM ......................................................... 10 2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM .......................................... 10 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM ............................................. 12 2.3.3.1 Thời gian ................................................................................... 12 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn ............................... 13 2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái ........................................... 13 2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng .................... 13 2.4 Phó tinh hoàn ................................................................................................. 13 2.5 Tinh trùng ...................................................................................................... 15 2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng ..................................................................... 15 2.5.2 Quá trình sinh tinh ............................................................................... 16 2.5.3 Cấu tạo................................................................................................. 16 2.5.4 Thành phần .......................................................................................... 17 2.5.5 Đặc tính sinh lý ................................................................................... 17 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng ........................... 18 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) ................................ 19 2.6.1 Lịch sử IVF ......................................................................................... 19 2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh ......................................................................... 20 2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi ........................................................ 21 2.6.4 Vật liệu cho IVF ................................................................................. 22 2.6.4.1 Giao tử ...................................................................................... 22 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF ......................................................................... 22 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro .............................................................. 23 2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh ................................................................... 24 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF ........................................................... 25 Chƣơng 3: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 26 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 26 3.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26 3.3 Vật liệu........................................................................................................... 26 viii 3.3.1 Nguồn mẫu .......................................................................................... 26 3.3.2 Hóa chất............................................................................................... 27 3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng ........................................................... 27 3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng .................................................... 29 3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh ....................................................... 30 3.3.3 Dụng cụ - thiết bị ................................................................................. 31 3.3.3.1 Dụng cụ ..................................................................................... 31 3.3.3.2 Thiết bị ...................................................................................... 31 3.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 32 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng .......................................................... 32 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng ............................................................... 32 3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert-TALP và TYH .................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 33 3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ .......................................................... 33 3.5.2 Xử lý buồng trứng ............................................................................... 35 3.5.3 Tìm và rửa trứng ................................................................................. 35 3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ............................................................ 35 3.5.5 Nuôi trứng ........................................................................................... 36 3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi ............................................ 36 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi ..................................................... 36 3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi ...................................................... 37 3.5.7 Nhuộm trứng ....................................................................................... 38 3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ .............................................................. 39 3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng ................................................. 39 3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng ................................ 39 3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: ........... 39 ix 3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh ........................................................................ 40 3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP .................................... 41 3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH .............................................. 42 3.6 Xử lý số liệu.................................................................................................. 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................... 43 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ β-mercaptoethanol ............................................................. 43 4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng .. 44 4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert - TALP ....................................................... 47 4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF ................................................................. 48 4.4.1 Lấy mẫu ............................................................................................. 48 4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm ..................................................... 49 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 50 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 50 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50 x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A Anaphase Kỳ sau BAS Bovine adult serum Huyết thanh bò trƣởng thành BSA Bovine serum albumine Albumine huyết thanh bò cm centimet COC Cumulus oocyte complex Phức hợp trứng - cumulus Ctv Cộng tác viên ECS Estrous cow serum Huyết thanh bò lên giống EGF Epidermal growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô Et al Cộng sự FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bò FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn GSH Glutathione GV Germinal vesicle Túi mầm GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong cơ thể sống UI Unit international Đơn vị quốc tế IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM In vitro maturation Trƣởng thành trong ống nghiệm LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng M Metaphase Kỳ giữa mm milimet NCSU North Carolina State University T Telophase Kỳ cuối xi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng ....................... 6 Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân .............................................................. 8 Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành ............................................................................. 9 Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng ................................... 20 Hình 2.5. Các giai đoạn phát triển của phôi ............................................................. 21 Hình 3.1. Buồng trứng ............................................................................................. 26 Hình 3.2. Tinh hoàn ................................................................................................. 27 Hình 3.3. Phó tinh hoàn ............................................................................................ 27 Hình 3.4. Thao tác mổ lấy buồng trứng ................................................................... 35 Hình 3.5. Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ................................................................. 36 Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi..................................................................... 37 Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus................................................................. 38 Hình 4.1. Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein ........................... 46 Hình 4.2. Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn ................................ 46 Hình 4.3. Tiền nhân sau 24 giờ ................................................................................ 47 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .......................... 43 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ............... 45 xii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn ..................... 15 Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó .................................................................... 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .............................. 43 Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ................... 45 Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP ............................. 47 Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng ........................................................................... 38 Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh .................................................................................... 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Trong sinh sản vô tính nổi bậc nhất là tạo con vật cloning, còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro culture - IVC), mục tiêu là cải tiến, hoàn thiện quy trình tái sinh sản động vật trong điều kiện in vitro gần giống nhƣ điều kiện in vivo để từ đó đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố sinh lý và sinh hóa làm cơ sở cho các nghiên cứu khoa học và y học phục vụ cuộc sống. Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) là một giai đoạn quan trọng trong toàn bộ quy trình tạo phôi. Phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi t