Khóa luận Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai pb260 x ro44/268 bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- o0o ------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH ThS. LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS. TRẦN THANH Tháng 08/2007 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . TS. Bùi Minh Trí, ThS. Lại Văn Lâm và KS. Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. ThS. Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT PHẠM NGỌC CHINH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “ Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ ThS. LẠI VĂN LÂM KS. TRẦN THANH Cây cao su là cây công nghiệp cây có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Chính vì vậy, công tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng. Tuy nhiên, sự giới hạn về nguồn gen ở các nƣớc châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su. Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Những kết quả đạt đƣợc: - Kết quả thí nghiệm trên 2 primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại - Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024 v đến 0,478. Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có biến lƣợng di truyền khá rộng. - Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chƣa có mối liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng) và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12. Qua kết quả trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268. Kết quả đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cây cao su Hevea. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................. iv MỤC LỤC ............................................................................................................. vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................... xi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU ................................................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu ..................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................... 2 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI .......................................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU ............................................. 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên ................................................................. 4 2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới .............................................. 4 2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su ............................................................. 5 2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su ................................................. 8 2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su .................................................................. 9 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ ............................................. 11 2.2.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 11 2.2.2 Chỉ thị isozyme ........................................................................................ 11 vii 2.2.3 Chỉ thị DNA ............................................................................................ 12 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) .... 12 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ...... 12 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) ......................................... 13 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) ........... 13 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ........ 13 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ............... 14 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................... 14 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 21 3.1.1 Vật liệu di truyền ..................................................................................... 21 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm................................................................................. 21 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA ...................................................................... 21 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD ........................................... 21 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 22 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 22 3.2.1 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 22 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 22 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA ................................................... 22 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu .......... 23 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA ................................................................ 24 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại ....................... 24 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả ............................................................... 24 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ........................................................... 25 4.1 LY TRÍCH DNA ............................................................................................ 25 viii 4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose ........... 25 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) ............................................................................................................ 26 4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD ........................................ 26 4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ................................................................. 27 4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER ......................................... 29 4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI ................ 29 4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI ............................................... 34 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ............................................................... 37 5.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 37 5.2 ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 39 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 43 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair Ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonuleotide acid dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate Kb: kilo base NTSYSpc: Numercial Taxonomy System OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism Taq: Thermus aquaticus UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam SALB: South American Leave Blight x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD ................... 27 Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................. 27 Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer ...................................... 29 Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu ............... 30 Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các con lai nghiên cứu ...................... 31 Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố (RO44/268) của chúng. ........................................................................................ 32 Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai. ............................... 33 Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai .............................. 33 Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng và sản lƣợng của các con lai ....... 35 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR ............................................................................. 16 Hình 4.1: DNA của các dòng vô tính cao su trên gel agarose 1% ........................ 25 Hình 4.2-A: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer A18 .......... 28 Hình 4.2-B: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer OPB12 ..... 28 Hình 4.2-C: Băng DNA của các con lai còn lại đƣợc khuếch đại với cả 2 primer ............................................................................................................................... 29 Hình 4.3: Cây phân nhóm di truyền của các con lai đƣợc thiết lập dựa trên cơ sở dữ liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA ............. 36 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây cao su, Hevea brasiliensis Muell. Arg thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae có nguồn gốc từ vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ. Vùng sinh thái tự nhiên của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. (Trần Thị Thúy Hoa, 1998). Cây cao su là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Cây cao su là loài cây cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, đƣợc xếp sau dầu hỏa, than đá và gang thép. Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn có khả năng cung cấp một khối lƣợng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh doanh. Mặt khác, hiện nay cây cao su còn đƣợc xem là thành phần trong cơ cấu cây trồng có thể đáp ứng chủ trƣơng phủ xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng, cải tạo môi sinh. Tuy nhiên, sự giới hạn nguồn gen ở các nƣớc châu Á là yếu tố quan trọng nhất gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). Chính vì vậy, các nƣớc trồng cao su trên thế giới đã cố gắng giải quyết vấn đề này bằng cách di nhập bổ sung nguồn vật liệu giống hoang dại của các loài trong chi Hevea từ vùng nguyên quán Amazon. Tại Việt Nam từ năm 1997, một số kiểu di truyền Amazon triển vọng đã đƣợc đƣa vào các chƣơng trình lai tạo giống nhằm mở rộng nguồn gen trong công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). 2 Những nghiên cứu về di truyền trên cây cao su có thể giúp cho các nhà chọn giống trong việc chọn bố mẹ, định hƣớng chƣơng trình cải tiến giống và khả năng sử dụng các chỉ tiêu tuyển non cho nghiên cứu di truyền để phát hiện ngay ở giai đoạn non những dòng vô tính có thể làm bố mẹ tốt (Sherpherd, 1969; Simmonds, 1969; Gilbert và ctv, 1973; Nga và Subramaniam, 1976; Tan, 1987; Tan và ctv, 1979; Kavitha K. M. và ctv, 1990; Licy J., 1992; Lê M. T., 1998; Goncalve và ctv, 1998, 2004; Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu di truyền đã đƣợc tiến hành trên nguồn gen Amazon để ƣớc lƣợng các thông số di truyền, đánh giá độ lớn và bản chất của các biến lƣợng di truyền, định lƣợng tiến bộ di truyền và dự đoán phƣơng pháp chọn giống tốt nhất (Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006). Hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiên đề tài “Đánh giá biến lƣợng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD”. 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu Đánh giá biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 bằng marker RAPD. Qua đó cung cấp tƣ liệu cho chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền Amazon. 1.2.2 Yêu cầu - Ly trích DNA của các con lai, đảm bảo hàm lƣợng và độ tinh sạch cao, làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD. - Đánh giá đƣợc biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 qua việc phân tích RAPD. 3 - Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính sinh trƣởng hoặc sản lƣợng của các con lai. - Nắm vững kỹ thuật PCR, thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện. - Sử sụng thành thạo các phần mềm xử lý thống kê sinh học nhƣ: NTSYS-pc, Excel. 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI Do giới hạn về thời gian nên các nghiên cứu của đề tài chỉ phân tích RAPD dựa trên 2 primer A18 và OPB12. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg) là một loài thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae. Trong chi Hevea, còn có 9 loài Hevea khác: H. benthamiana, H. camargona, H. camporum, H. guianensis, H. nitida, H. microphylla, H. pauciflora, H. rigidifolia và H. spruceana. Mặc dù tất cả các loài Hevea đều có mủ cao su nhƣng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và đựợc trồng rộng rãi nhất. Cây cao su mọc tự nhiên ở vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ, trải rộng từ vĩ tuyến 150 Nam đến vĩ tuyến 60 Bắc và kinh tuyến 460 - 770 Tây, bao gồm các nƣớc: Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Ngoài vùng xuất xứ trên, ngƣời ta không thấy cây cao su mọc tự nhiên ở nơi nào khác trên thế giới (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Vùng sinh thái của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa dạng với lƣợng mƣa trung bình từ 1.500 - 2.000 mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô từ 1 đến 5 tháng, nhiệt độ trung bình 280C. Trong vùng Amazon, cây cao su phát triển chủ yếu trên nền đất sét giàu dinh dƣỡng, có độ pH dao động từ 4,5 - 5,5 với tầng đất canh tác sâu, thoát nƣớc trung bình (Nguyễn Thị Huệ, 1997). 2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới Năm 1876 đã mở đầu cho công cuộc phát triển cao su trồng với sự thành công trong việc đƣa hạt cao su từ Brazil sang các nƣớc châu Á của Henry Wickham. 5 Từ đó cây cao su đã phát triển rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và một phần nhỏ ở châu Mỹ La tinh (Võ Thị Thu Hà, 1996). Sau năm 1889, các vƣờn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, sản lƣợng mủ cao su ở các nƣớc này nhanh chóng giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan. Theo thống kê năm 2002, tổng diện tích cao su trên toàn thế giới khoảng 9 triệu ha và sản lƣợng khoảng 7,4 triệu tấn, trong đó các nƣớc châu Á chiếm khoảng 94% tổng sản lƣợng, gồm các nƣớc: Thái Lan (28,7%), Indonesia (24,9%), Malaysia (16,9%), Ấn Độ (10%), Trung Quốc (6,1%), Việt Nam (3,3%), Srilanka (2,1%), các nƣớc châu Á khác (2,1%), châu Phi chiếm khoảng 4,4% và châu Mỹ là 1% tổng sản lƣợng cao su trên thế giới. Năng suất cao su trung bình biến thiên từ 1.500 - 1.800 kg/ha/năm tuỳ thuộc vào trình độ ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và quản lý của từng quốc gia trồng cao su (Phạm Hải Dƣơng, 2002). Đến năm 2005, tổng diện tích cao su Việt Nam đạt khoảng 480.200 ha, tổng sản lƣợng đạt 468.600 tấn, năng suất bình quân đạt 1.480 kg/ha/năm, trong đó bình quân năng suất của Tổng Công ty Cao su Việt Nam là 1.728 kg/ha (Trần Thị Thúy Hoa, 2006) 2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su Cây cao su là loài đại mộc, trong tự nhiên có thể sống đến 100 năm và cao từ 30 – 50 m, chiếm diện tích từ 20 – 40 m2, vòng thân có thể đạt 3 – 5 m, thƣờng là 1,5 m. Tuy nhiên, trên các vƣờn sản xuất, mức độ sinh trƣởng của cây cao su bị hạn chế, ít khi cao hơn 25 m, vòng thân khoảng 1 - 1,2 m do mật độ trồng dày, lại bị khai thác mủ liên tục và thƣờng bị cƣa đốn để tái canh sau 25 - 30 năm. Cây cao su có 3 lá chét, hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa đực gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo và tự thụ đều có thể xảy ra, quả có 3 mảnh vỏ chứa 3 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn với kích thƣớc khoảng 2 cm, trong hạt có chứa nhiều dầu, dễ mất sức nẩy mầm. Khi trên 4 - 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau thời kỳ thay lá. Ở Việt Nam, vụ hoa vào khoảng tháng 2 – 3 hàng năm, có khi rải rác trong t