Khóa luận Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng dendrobium thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh và rừng nam Cát tiên bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RƢ̀NG Dendrobium THU THÂP̣ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢ̀NG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUÂṬ RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG MINH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RƢ̀NG Dendrobium THU THÂP̣ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢ̀NG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ DUNG TRƢƠNG MINH DŨNG TS. VÕ THÁI DÂN CN. LƢU PHÚC LƠỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TA ̣ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Viêṇ Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ và Môi Trƣờng – Đaị hoc̣ Nông Lâm TP. HCM. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin trân troṇg gƣ̉i lời biết ơn đến các thầy cô: - TS. Trần Thị Dung - TS. Võ Thái Dân - CN. Lƣu Phúc Lợi Đa ̃tâṇ tình hƣớng dâñ , chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng nhƣ taọ điều kiêṇ tốt nhất cho viêc̣ thƣc̣ hiêṇ và hoàn tất đề tài tốt nghiêp̣ này. CN. Huỳnh Kim Hƣng và toàn thể các anh chị thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng – Đaị hoc̣ Nông Lâm TP. HCM đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm. Kỹ sƣ Huỳnh Tuấn Anh – trƣởng Traṃ khuyến nông huyêṇ Tân Phú , tỉnh Đồng Nai đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian thu mẫu tại rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Cô Nguyêñ Thị Cách và các anh Trƣờng , Tùng, chị Vân đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian thu mâũ taị Thành phố Hồ Chí Minh. Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. TP. HCM, tháng 09 năm 2007 Trƣơng Minh Dũng iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRƢƠNG MINH DŨNG , Đaị hoc̣ Nông Lâm Tp . Hồ Chí Minh, 9/2007. “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thâp̣ taị Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuâṭ RAPD.” Hôị đồng hƣớng dâñ: TS. Trần Thi ̣ Dung, TS. Võ Thái Dân, CN. Lƣu Phúc Lơị. Điạ điểm nghiên cƣ́u : Viêṇ Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ và Môi Trƣờng , Đaị hoc̣ Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Viêṭ Nam sở hƣ̃u nhiều nguồn gen quý hiếm, đôc̣ đáo, mới la ̣của giống lan rƣ̀ng Dendrobium. Các giống Dendrobium không nhƣ̃ng đep̣ , giá trị kinh tế cao , mà còn có giá trị y học . Vì vậy, trƣớc hết chúng ta cần phải khảo sát sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan rừng Dendrobium, tạo nền tảng cho công tác bảo tồn và tạo các giống mới, trên cơ sở đó, xây dƣṇg thƣơng hiêụ cho cây lan Viêṭ Nam . Thiết lâp̣ quy trình li trích DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá có đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇ h cao. Bên caṇh đó , xây dƣṇg phản ƣ́ng PCR với primer RAPD cho tính đa hình cao . Tƣ̀ đó, phân tích tính đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium thu thâp̣ tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên dựa trên phần mềm NTSYSp c Version 2.1 và Winboot. Quy trình li trích DNA tƣ̀ mâũ lá có đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇh cao đa ̃đƣơc̣ tối ƣu thành công . 6 primer ngâũ nhiên : OPAC10, OPAH13, 0PB01, OPB08, S1384, U693 đƣơc̣ dùng trong phân tích đa daṇg di truyền của các giống lan khảo sát bằng kỹ thuật RAPD . Trên cơ sở đó , xây dƣṇg sơ đồ phân nhóm di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium. Sơ đồ phân nhóm di truyền cho thấy các giống lan khảo sát có sƣ ̣đa daṇg cao về măṭ di truyền, phân thành 5 nhóm với mức tƣơng đồng gen từ 0.39 – 0.79. v SUMMARY Genetic diversity analysis of wild Dendrobium stem at Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest by RAPD Supervisor: Tran Thi Dung 1 , PhD; Vo Thai Dan 2 , PhD; Luu Phuc Loi 1 , BSc Student: Truong Minh Dung 1 1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city 2 Faculty of Agriculture, Nong Lam university, Ho Chi Minh city To analysis the genetic diversity of wild Dendrobium orchid, six decamers were used for 10 wild Dendrobium species, collected from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province). Collecting 10 species from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province), optimizing of protocols for DNA extraction and purification, constructing of protocol for RAPD, analyzing the genetic of 10 wild Dendrobium species by RAPD and constructing the dendrogram by NTSYSpc 2.1 software, Winboot program are the objective of the study. Methods - To identify 10 wild Dendrobium species with genotype. - Extraction of total DNA from fresh tissue of 10 wild Dendrobium species. - Six random primer: OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, U693 were used to analysis of genetic diversity. - Following RAPD reactions, dendrogram were constructed by NTSYSpc 2.1 and Winboot program. Conclusion Six decamers are enough to compare the identity of all samples. We could use those primers to establish the methodology to perform genetic comparisons in Vietnam. Besides, the genetic diversity among 10 wild Dendrobium species were established to support the breeder overcome difficulties in plant salection. vi MỤC LỤC CHƢƠNG Trang LỜI CẢM TA ̣.................................................................................................. iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ............................................................................... iv SUMMARY ..................................................................................................... v MỤC LỤC ....................................................................................................... vi DANH SÁCH CHƢ̃ VIẾT TẮT ..................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................ x DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ........................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................. xi 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 2 1.2. Mục tiêu – nôị dung – yêu cầu đề tài ........................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ ............................................................................ 3 2.1.Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium................................ 3 2.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................. 3 2.1.2. Các nhóm lan Dendrobium .................................................................... 5 2.1.3. Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài .............................. 6 2.2. Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật .................................................. 8 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR ....................................................................... 11 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR ................................................................ 11 2.3.2. Thành phần thực hiện một phản ứng PCR ............................................ 14 2.3.2.1. Mẫu ..................................................................................................... 14 2.3.2.2. Primer ................................................................................................. 14 2.3.2.3. dNTP ................................................................................................... 16 2.3.2.4. MgCl2 ................................................................................................. 17 2.3.2.5. Taq ...................................................................................................... 17 vii 2.3.5.6. Buffer .................................................................................................. 17 2.4. Đa dạng di truyền – một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................................................... 18 2.4.1. Đa dạng di truyền .................................................................................. 18 2.4.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền .............................. 18 2.4.2.1. Phƣơng pháp chỉ thị hình thái ............................................................. 18 2.4.2.2. Phƣơng pháp chỉ thị isozyme ............................................................. 19 2.4.2.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị phân tử ...................................................... 19 2.5. Đánh giá sƣ ̣đa daṇg di truyền bằng phần mềm NTSYSpc và Winboot .. 26 2.5.1. NTSYSpc version 2.1 ............................................................................ 26 2.5.2. Winboot ................................................................................................. 28 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan ................................................... 29 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 29 2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc .......................................................... 31 3. VÂṬ LIÊỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................................ 32 3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm ............................................................... 32 3.1.1. Nội dung ................................................................................................ 32 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ......................................................... 32 3.2. Vật liệu...................................................................................................... 32 3.2.1. Các giống lan Dendrobium thí nghiệm ................................................. 32 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................... 34 3.2.3 Hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 34 3.3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu .................................................... 36 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 36 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 36 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ......................................................................... 45 4.1. Điều tra và thu thâp̣ các giống lan rƣ̀ng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái .................. 45 viii 4.2. Tối ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá tƣơi cho đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇh cao ............................................................................. 48 4.3. Xây dƣṇg quy trình PCR dƣạ trên kỹ thuâṭ RAPD cho tính đa hình cao ....................................................................................................... 53 4.4. Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium dựa trên 30 primer RAPD ................................................................................ 54 4.5. Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot ........................................ 60 5. KẾT LUÂṆ - ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 69 5.1. Kết luâṇ ..................................................................................................... 69 5.2. Đề nghi.̣..................................................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 71 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EB: extraction buffer EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid mM: milimolar (milimol/lite) NCT: Nam Cát Tiên OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction pmol: Picomol RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RNA: Ribonucleic acid Rnase: Ribonuclease SSR: Simple Sequence Repeat Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp) TAE: Tris – Acetate – EDTA TE: Tris – EDTA Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) TP. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh U: Đơn vị hoạt tính UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic VNTR: variable number tandem repeat x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG Trang Bảng 2.1. Nồng độ agarose và kích thƣớc đoạn cần phân tách. ...................... 11 Bảng 3.1. Primer .............................................................................................. 34 Bảng 3.2. Các giống lan thu thập từ Tp. Hố Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên ..................................................................................... 37 Bảng 3.4. Điểm khác nhau giữa 3 quy trình li trích. ....................................... 40 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR. ................................ 42 Bảng 3.6. Quy trình PCR. ................................................................................ 42 Bảng 4.1. So sánh các đăc̣ trƣng về lá của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium .. 46 Bảng 4.2. So sánh các đăc̣ trƣng về thân của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium ..................................................................................................... 47 Bảng 4.3. Tỉ lệ DNA tổng số tinh sạch trong 3 quy trình li trích khảo sát ...... 50 Bảng 4.4. Nồng đô ̣DNA (ng/µl) tổng số theo 3 quy trình .............................. 51 Bảng 4.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ................................. 53 Bảng 4.6. Quy trình PCR ................................................................................. 53 Bảng 4.7. Số band khuếch đại và band đa hình trên một số primer. ............... 55 Bảng 4.8. Hệ số đồng dạng của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên ........................................ 62 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ DNA mẫu tổng số tinh sạch li trích theo 3 quy trình khảo sát. ........................................................................................ 50 Biểu đồ 4.2. Biểu đồ thể hiện tính ổn định của 3 quy trình khảo sát. ............. 51 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH Trang Hình 2.1. Các giống lan rừng Dendrobium ..................................................... 5 Hình 2.2. Nguyên lí của phản ứng PCR .......................................................... 13 Hình 2.3. Nguyên lí của phản ứng RFLP. ....................................................... 21 Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP. ....................................................... 23 Hình 2.5. Nguyên lí của phản ứng RAPD ....................................................... 25 Hình 2.6. Nguyên lí của phản ứng microsatellite... ......................................... 26 Hình 2.7. Giao diêṇ NTSYSpc 2.10m ............................................................. 27 Hình 2.8. Giao diêṇ chƣơng trình Winboot ..................................................... 29 Hình 3.1. Các giống lan Dendrobium nghiên cứu trong đề tài. ....................... 33 Hình 4.1. So sánh các đăc̣ trƣng về lá của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium ... 45 Hình 4.2. DNA li trích theo quy trình 1........................................................... 49 Hình 4.3. DNA li trích theo qui trình 2 ........................................................... 49 Hình 4.4. DNA li trích theo quy trình 3........................................................... 50 Hình 4.5. Ảnh điêṇ di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 54 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 55 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 56 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 56 Hình 4.9. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 57 Hình 4.10. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 57 Hình 4.11. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................ 58 xii Hình 4.12. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 58 Hình 4.13. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 59 Hình 4.14. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 59 Hình 4.15. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 60 Hình 4.16. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 60 Hình 4.17. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 61 Hình 4.18. Sơ đồ phân nhóm di truyền dựa trên kết quả RAPD đối với nhóm lan rừng Dendrobium thu thập từ Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên .......................................................................................................... 63 Hình 4.19. Sơ đồ PCA dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái của các giống lan rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 64 Hình 4.20. Sơ đồ 3D PCA dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái của các giống lan rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 65 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hoa lan là một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị, không những góp phần tích cực vào việc nâng cao hiệu quả sử dụng lao động, đất, nƣớc và các nguồn lực khác, mà còn làm cho chất lƣợng môi trƣờng sống ngày càng mỹ quan hơn. Vì vậy phát triển hoa lan là một xu thế