Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Đinh Duy Kháng, TS. Bùi Minh Trí, TS. Lê Đình Đôn, anh Nguyễn Đức Toàn đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng các anh chị trong Chi Cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Chú Nguyễn Văn Sang và các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đơn Dƣơng, anh Nguyễn Tấn Ngọc cùng các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đức Trọng đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn tôi. Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó, góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua. iv TÓM TẮT Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính. 1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên cứu. 2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu đang nghiên cứu hay không. 3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn. Kết quả thu đƣợc: - Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt. - Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm nghiên cứu. - Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào. v SUMMARY This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th , 2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3th, 2005 to 8 th , 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University. The objects of this research are as follows: - Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts can be evaluated. - Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus. - Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus and confirm DAS-ELISA results. The results of this research are as follows: - Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by viruses. - DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3 th , 2005 while Tobacco Mosaic Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these areas. - Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but the product has not been confirmed yet. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm tạ . ................................................................................................................. i Tóm tắt ...... ................................................................................................................ ii Tóm tắt bằng tiếng Anh ............................................................................................ iii Mục lục ..... ............................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii Danh sách các bảng, biểu đồ .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1 1.2. Mục đích yêu cầu ..................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ......................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1. Cà chua ..................................................................................................... 3 2.1.1. Sơ lƣợc về cà chua ......................................................................... 3 2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới ................................ 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt .............................................. 4 2.2. Bệnh hại trên cà chua ............................................................................... 4 2.2.1. Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) ........................... 6 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra ..................................... 6 2.2.1.2 Phân loại của TSWV .......................................................... 7 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế .................. 7 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV ........................................................ 8 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV ....................................................................... 8 2.2.1.6 Tính chất của TSWV .......................................................... 9 2.2.1.7 Vector truyền ...................................................................... 9 vii 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV ............................ 10 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh ................................................................ 11 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV ............................................... 11 Cây kháng ...................................................................... 11 Quản lý TSWV ............................................................... 12 2.2.2. Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) ................................... 14 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh ................................................................. 14 2.2.2.2 Phân loại của TMV ............................................................. 14 2.2.2.3 Sự phân bố của TMV .......................................................... 14 2.2.2.4 Ký chủ của TMV ................................................................ 14 2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV ................................................ 14 2.2.2.6 Tính chất của TMV ............................................................. 16 2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh ........................................................ 17 2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV ....................................... 17 2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV ................................................. 17 2.2.2.10 Phòng trừ .......................................................................... 19 2.2.3. Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) ................................. 19 2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV .................................................. 19 2.2.3.2 Phân loại CMV ................................................................... 20 2.2.3.3 Phạm vi phân bố ........................................................................... 21 2.2.3.4 Ký chủ ................................................................................. 21 2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV ................................................ 21 2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV ................................................. 23 2.2.3.7 Sự truyền bệnh .................................................................... 24 2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh ............................................. 24 2.2.3.9 Triệu chứng .................................................................................. 25 2.2.3.10 Phòng trừ ........................................................................... 25 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật ............................ 26 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị ............................ 26 viii 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu ..................................... 26 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học ................................ 26 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh ..................... 27 2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. ............................................... 28 2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA ............................................ 28 2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. ........................................... 28 Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA) ................................ 28 Indirect Sanwich ELISA ................................................ 28 2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) ....................................... 28 2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor .......... 28 2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. ................... 29 2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphirm) .................................................................. 29 2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA ................... 29 2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác ............................... 29 2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng probe đánh dấu ............................... 29 2.3.5.5 Array ................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp DAS-ELISA và phƣơng pháp RT-PCR ............................. 30 2.4.1. Phƣơng pháp DAS-ELISA ............................................................. 30 2.4.2. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................... 30 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây ...................................... 32 2.5.1. Ở nƣớc ngoài .................................................................................. 32 2.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 33 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 34 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................... 34 3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài .............................................................. 34 3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 34. ix 3.2. Vật liệu ..................................................................................................... 34 3.2.1. Dụng cụ .......................................................................................... 34 3.2.2. Hóa chất ........................................................................................ 34 3.3. Phƣơng pháp ............................................................................................. 35 3.3.1. Điều tra và lấy mẫu ....................................................................... 35 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................ 35 3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA ............................................. 35 3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR ................................................... 36 Ly trích RNA ................................................................. 36 Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA ............ 37 Phản ứng PCR ................................................................ 38 3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR ..................................................... 44 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 46 4.1. Phản ứng ELISA ....................................................................................... 46 4.1.1. Kết quả ELISA ............................................................................... 46 4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV .................................................. 47 4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra ................ 48 4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra ............... 49 4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra .............. 51 4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm .............................. 52 4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát đƣợc ............................. 53 4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR ................................................................ 57 Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 ............................................... 57 Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 ..................................... 62 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 70 5.1. Kết luận .................................................................................................... 70 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 71 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 73 1 2 x PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA ............................... 76 PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. ............................. 77 PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR ..................................... 78 PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA ............................ 79 PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra ............................................................................. 80 PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tƣơng đồng với TMV dòng ở Trung Quốc dùng để thiết kế primer. ......................................................................... 81 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMV: Cucumber Mosaic Virus TMV: Tobacco Mosaic Virus TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus CTV: Citrus Tristeza Virus TLCV: Tomato Leaf Curl Virus (bệnh xoăn ngọn cà chua) TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (bệnh xoăn vàng ngọn), TRSV: Tomato Black Ring Virus (bệnh đốm hình nhẫn) TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus (bệnh lùn bụi cà chua) PV Y: Potato Virus Y PV X: Potato Virus X DMSO: dimethyl sufoxide ELISA: enzyme linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction N: Nucleoprotein cDNA: complementary DNA ssRNA : single strand RNA MP: Movement Protein (Protein di chuyển) CP: Coat Protein (Protein vỏ) ORF: open reading frame m 7 Gppp: 7- methyl guanosine triphosphate HR: Hypersensitive Response (phản ứng siêu nhạy cảm) SAR: system acquired resistance (tính kháng có hệ thống) PR protein: pathogenesis- related protein VPg : protein liên kết với genome satRNA: satellite RNAs (RNA vệ tinh) DEP : delution end point LIV : longevity invitro TIR : thermal inactivation range. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ BẢNG, BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV, TMV và CMV trên tổng số mẫu. ........................................................................... 47 Bảng 4.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV. .......................... 48 Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) bệnh virus theo tuổi cây trong tổng số mẫu điều tra. ................................................................................. 49 Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh TMV, CMV và TSWV giữa Đơn Dƣơng và Đức Trọng. .................................................... 50 Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ........................ 53 Bảng 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 53 Biểu đồ 4.1 Biểu diễn tỷ lệ dƣơng tính và âm tính CMV, TMV, TSWV. 47 Biểu đồ 4.2 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm giữa các mẫu nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV. ........ 48 Biểu đồ 4.3 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm virus theo tuổi cây .. 49 Biểu đồ 4.4 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến