Khóa luận Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin

i ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ 2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN Tác giả ĐẶNG THỊ MỸ LỆ ĐỖ THỊ XUÂN VUI Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu Cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học Giáo viên hướng dẫn Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH Th.S LÊ XUÂN TIẾN Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN Tháng 08/2009 ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học Bách Khoa TP. HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009. Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Tiến trình thực hiện đề tài như sau: 1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid - Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội). - Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR. Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% và có thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiếp theo. 2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine – Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC), 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC). – Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột. – Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy. – Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổIR, MS, NMR. Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2 dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học. iv 3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin – Hoạt tính kháng ung thư. – Hoat tính kháng oxy hóa. – Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. – So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt tính sinh học của curcumin. Kết quả: Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC và HBTC đều thể hiện hoạt tính kháng oxi hoá trong thử nghiệm DPPH và MDA tuy nhiên hoạt tính thấp hơn Cur. DFPHC và Cur đều thể hiện hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào Hep – G2. Ngoài ra DFPHC và HBTC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhưng hoạt tính này không đáng kể với các chủng vi khuẩn, vi nấm đã khảo sát. v MỤC LỤC Trang tựa ......................................................................................................................... i Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii Tóm tắt ............................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các từ viết tắt .............................................................................................. viii Danh sách các hình ........................................................................................................ ix Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................... xii Chương 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2 1.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 2 1.4. Yêu cầu ..................................................................................................................... 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 2.1. Tổng quan về curcumin ............................................................................................ 4 2.1.1. Curcuminoid .......................................................................................................... 4 2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid .............................................................. 4 2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid .......................................................... 5 2.1.2. Curcumin ............................................................................................................... 6 2.1.2.1. Lý tính ................................................................................................................. 6 2.1.2.2. Hóa tính .............................................................................................................. 7 2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. ................................................... 14 2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư ...................................................................................... 15 2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa ...................................................................................... 16 2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur .................................................... 17 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23 3.1. Sơ đồ thực nghiệm .................................................................................................. 23 3.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 24 3.2.1. Phân lập curcumin ................................................................................................ 24 vi 3.2.1.1. Kết tinh lại ........................................................................................................ 25 3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ................................................................................... 26 3.2.1.3. Sắc ký cột ......................................................................................................... 27 3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. ........................................................... 29 3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin .................................... 29 3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin ................................ 32 3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp .............................................. 35 3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). ...................................................................... 35 3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR) ......................................................................................... 35 3.2.3.3. Khối phổ .......................................................................................................... 35 3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................................................ 35 3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................................ 35 3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ................... 35 3.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA ................ 37 3.2.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC ................... 38 3.2.4.4. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư .................................................................... 39 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 41 4.1. Phân lập curcumin .................................................................................................. 41 4.1.1. Kết tinh lại curcuminoid ...................................................................................... 41 4.1.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 42 4.1.3. Nhận danh cấu trúc hóa học ................................................................................ 43 4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin ........................................................... 43 4.1.3.2. Biện luận cấu trúc của curcumin ...................................................................... 44 4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin ........................................ 46 4.2.1. Theo dõi phản ứng ............................................................................................... 46 4.2.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 47 4.2.3. Nhận danh cấu trúc .............................................................................................. 48 4.2.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 48 4.2.3.2. Biện luận cấu trúc của HBTC ........................................................................... 48 4.3.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 52 4.3.3. Biện luận cấu trúc ................................................................................................ 53 vii 4.3.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 53 4.3.3.2. Biện luận cấu trúc của DFPHC ........................................................................ 53 4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học ........................................................................ 56 4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................................................... 56 4.4.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH .................... 56 4.4.1.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA ................ 58 4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................................... 60 4.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..................................................................... 61 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 62 5.1. Kết luận ................................................................................................................... 62 5.2. Kiến nghị. ............................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 67 viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : Curcumin DMC : Demethoxycurcumin BDMC : Bisdemethoxycurcumin HC : Hydrazinocurcumin IOZ : Isoxazolcurcumin HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin DFPHC : 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin OD : Mật độ quang HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá CS : là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được thử tính theo % so với chất đối chứng IC50 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration) IC70 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc gốc tự do MIC : Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration) HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MS : Khối phổ (Mass spectrometry) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) TLC : Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography). ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid .................................................... 4 Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur ........................................ 6 Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH .............................................................................. 8 Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm ...................................................... 9 Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur ................................................................................... 10 Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá ................................................................................ 11 Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường. ................................................................................................................ 12 Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin .................................... 12 Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch ................................................................... 13 Hình 2.10: Phức Cur với kim loại ........................................................................................ 13 Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do ....................................................................... 14 Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u ....................... 16 Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur ...................................................... 17 Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC ....................................................................................... 18 Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC .................................................................................... 18 Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư khác nhau (theo phương pháp MTT) ............................................................................................ 18 Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN ............ 19 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................ 20 Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid ........................ 20 Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin ................................................................ 21 Hình 2.20: Hydrazinocurcumin ..................................................................................... 21 Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC ............................................................................... 21 Hình 3.1: Phương pháp tính Rf ............................................................................................. 27 Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá ............................... 36 Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA ................................................................................... 37 Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh ....................... 41 x Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu được từ sắc ký cột ...................................................... 42 Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur (B) Cur: cur thu được qua sắc ký cột. ........ 42 Hình 4.4: Tinh thể Cur ........................................................................................................... 43 Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) của Cur ................................................................... 43 Hình 4.6: Curcumin, C21H20O6 (M=368). .......................................................................... 45 Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng ........................................................................................ 46 Hình 4.8: Sắc ký cột thô ........................................................................................................ 47 Hình 4.9: Sắc ký cột tinh ....................................................................................................... 47 Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH2Cl2:CH3OH: 97:3 v/v) ...... 48 Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C28H23SN3O4 (M=497) .................................................. 49 Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng ...................................................................... Hình 4.13: Sắc ký cột thô ...................................................................................................... 52 Hình 4.14: Sắc ký cột tinh .................................................................................................... 52 Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể của DFPHC và ..................................................................... 53 (B) TLC của DFPHC (silica gel, CH2Cl2:CH3OH: 98:2 v/v) ....................... 53 Hình 4.16: Cấu trúc của DFPHC, C27H22N2F2O4 (M=476) .............................................. 54 Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của HBTC, DFHTC, Cur theo phương pháp DPPH ....................................................................................................................................... 57 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid .......................................................... 4 Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid .......................................... 5 Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur ......................................... 7 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................ 20 Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại ...................................................................................... 25 Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi ......................................................................... 26 Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH ............................................................ 36 Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh ......................................................... 41 Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur ..................................................................... 44 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin ........................................................................ 45 Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC ................................................................. 48 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC ............................................................................. 49 Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC ............................................................. 53 Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC .......................................................................... 54 Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur theo phương pháp DPPH ............................................................................................................... 56 Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH ............... 56 Bảng 4.10: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH .................... 57 Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA ................... 58 Bảng 4.13: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA ..................... 59 Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC50