Khóa luận Định danh và phân nhóm nấm trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM ------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHÓM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHÓM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii “Không gì có thể so sánh đƣợc tình yêu tôi dành cho mẹ, ba, chị và em tôi, những ngƣời nắm giữ trái tim tôi trọn đời. Tôi luôn cảm thấy ấm áp bởi sự quan tâm và tình thƣơng chân thành của những ngƣời thân tộc dành cho tôi. Không bao giờ quên sự quan tâm, chia sẻ và những lời dạy dỗ của Thầy TS. Lê Đình Đôn, một ngƣời thầy lớn. Tôi luôn tự hào vì đã đƣợc học tập và rèn luyện ở trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và bộ môn Công nghệ sinh học nói riêng. Gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Văn Lẫm, chị Trần Thị Vân, Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, Phạm Thị Minh Kiều, Trịnh Thị Phƣơng Vy và các Anh, Chị ở viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Luôn nhớ đến các bạn cùng lớp DH03SH với tôi và các bạn khoa Nông học cùng làm chung ở phòng 105, bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, những ngƣời thật đáng mến. Có những giai đoạn thật khó khăn trong cuộc sống và tôi thật may mắn có đƣợc ngƣời bạn đã chịu đựng và luôn làm tôi cảm thấy ấm áp. Cảm ơn mày nhiều lắm Tuyền”. Nguyễn Thị Khả Tú iv TÓM TẮT Đề tài: “Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam” do Nguyễn Thị Khả Tú thực hiện từ 19/3/2007 đến ngày 19/8/2007 tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng Công nghệ sinh học thực vật, viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Mục đích Định danh tên loài 11 dòng nấm Trichoderma spp. phân lập ở Việt Nam. Phân nhóm và xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma spp.. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma spp. (Trichoderma) với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. Phƣơng pháp thực hiện Kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) với dữ liệu của chúng trên NCBI bằng phần mềm ClustalX 1.83. So sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Kết quả đạt đƣợc Khẳng định tên loài chính xác 10 dòng Trichoderma. Thiết lập và thể hiện rõ đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma. 11 dòng Trichoderma Việt Nam thuộc 5 loài T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens (trừ dòng T. asperellum (T6)) có quan hệ di truyền khá xa so với các dòng trên thế giới. 10 dòng có nguồn gốc bản địa và dòng v T. asperellum (T6) là dòng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Mối quan hệ di truyền giữa 5 loài này là bền vững và phù hợp với mối quan hệ về hình thái. Kết luận Với kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 có thể định danh chính xác tên loài và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các loài cũng nhƣ các dòng trong cùng loài của Trichoderma. Sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA và nhất là trình tự một phần vùng tef1 có thể phân biệt giữa dòng Trichoderma bản địa với các dòng ngoại lai. Mở ra triển vọng cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo của phƣơng pháp định danh trong đề tài. vi ABSTRACT “Identifying and grouping of Trichoderma spp. collected in Viet Nam”, thesis is carried out by Nguyen Thi Kha Tu, from 19 Mar, 2007 to 19 Aug, 2007 at Plant Protection Pepartment, Argonomy Faculty, Nong Lam University and Phytobiotechnology Laboratory, Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University. This thesis was based on molds identified results then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) stable and apart of tef1 (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) funtional regions with their data on NCBI to identifying species and grouping of 11 Trichoderma genus. Finally, ITS – rDNA and apart of tef1 regions of 11 Trichoderma genus were compared with their data at different ecological, geographic areas on over the world to clear the genetic relationship. The results show that confirming exactly the species of 10 Trichoderma genus, T68 genus was identified T. atroviride. Establishing and clearing the genetic relationship among 11 Trichoderma genus. In which, 11 Trichoderma genus in Viet Nam of 5 species T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum , T. virens (except T. asperellum genus (T6)) have a rather far genetic relationship from others in the world. 10 genus orginated from locality and T. asperellum (T6) is the one migrated in our country. Genetic relationship among 5 species is stable and suitable with morphological characteristics. vii MỤC LỤC TÓM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC HÌNH ...................................................................................... xii Chƣơng 1 ..................................................................................................................... 0 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 0 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 0 1.2. Mục đích ........................................................................................................ 0 1.3. Yêu cầu .......................................................................................................... 0 Chƣơng 2 ..................................................................................................................... 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 2 2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma ..................................................................... 2 2.1.1. Phân loại................................................................................................... 2 2.1.2. Nguồn gốc ................................................................................................ 2 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 3 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học ....................................................... 4 2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng ....................................... 4 2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma ........................................................................... 6 2.3. Các phƣơng pháp định danh tên loài nấm Trichoderma ................................ 7 2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA ........................................... 9 2.5. Giới thiệu về vùng tef1 ................................................................................. 10 2.6. Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass ....................... 10 2.7. Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA .................. 11 2.8. Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma ... 13 Chƣơng 3 ................................................................................................................... 15 viii VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................ 15 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu .................................................. 15 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 15 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 15 3.2. Hoá chất ....................................................................................................... 16 3.3. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 17 3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma. ................................................................. 17 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma ............................................................ 17 3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma ............................................................. 18 3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA ............................................... 18 3.8. Phản ứng PCR .............................................................................................. 19 3.9. Đánh giá kết quả PCR ................................................................................. 21 3.10. Định danh tên loài các dòng Trichoderma ................................................... 22 3.11. Phân nhóm tạo phổ hệ di truyền .................................................................. 24 3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới ............................ 24 Chƣơng 4 ................................................................................................................... 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 25 4.1. Kết quả ly trích DNA ................................................................................... 25 4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ........... 26 4.3. Kết quả định danh tên loài ........................................................................... 27 4.4. Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền ..................................................... 35 4.4.1. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ................................................................................................................ 35 4.4.2. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA ........ 37 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI...... 39 4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới................................................................. 41 Chƣơng 5 ................................................................................................................... 44 ix KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 44 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 44 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate. DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylene diamin tetracetic acid. PCR: Polymerase chain reaction. RAPD: Random amplified polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid. SDS: sodium dodecyl sulfate. Taq: Thermus aquaticus. TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid. TE: Tris ethylene diamine tetra acetate. Tm: Melting Tempereture (nhiệt độ nóng chảy). U: Đơn vị hoạt tính. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài ........... 15 Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng ............................... 20 Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng ....... 21 Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ................................................................... 21 Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI ....... 22 Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI ..................... 23 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 5 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T33 với các loài trên NCBI ............ 30 Bảng 4. 6 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T2 với các loài trên NCBI .............. 30 Bảng 4. 7 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T14 với các loài trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 8 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T85 với các loài trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 9 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T88 với các loài trên NCBI ............ 32 Bảng 4. 10 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T6 với các loài trên NCBI ............. 32 Bảng 4. 11 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T68 với các loài trên NCBI ........... 33 Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên loài các dòng Trichoderma của đề tài ............... 33 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trƣờng PDA sau 2 – 3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) ................... 3 Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI ............................................................................... 9 Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 . 20 Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F .............................. 20 Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút .............................................................. 26 Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút ............ 26 Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thƣớc 600 bp ...................................................................................... 27 Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F, có kích thƣớc 320bp ............................................................. 27 Hình 4. 5 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một phần vùng tef1 (B). ...................................................................................................... 36 Hình 4. 6 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B) ................................................................................................................... 38 Hình 4. 7 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với dữ liệu của chúng trên thế giới. ............................................................................. 40 Hình 4. 8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma ....... Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 43 Hình 4. 9 Kết quả so sánh trình tự một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 42 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm Trichoderma là một loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh hại cây trồng và có khả năng kích thích sự phát triển của bộ rễ cây. Việc khai thác tiềm năng của Trichoderma dƣới dạng chế phẩm sinh học nhƣ một tác nhân sinh học phòng trừ nhiều bệnh hại cây trồng, giúp cho cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn đã và đang đƣợc các nƣớc trên thế giới trong đó có nƣớc ta rất quan tâm nhằm tạo sản phẩm nông nghiệp không có dƣ lƣợng thuốc hóa học là một yêu cầu bắt buộc vì sức khỏe cộng đồng, xuất khẩu và cân bằng môi trƣờng sinh thái, hƣớng đến một nền nông nghiệp bền vững. Vì thế, việc định danh chính xác tên loài và xác định mối quan hệ di truyền của chúng trở nên thật cần thiết. Nhƣng do hệ thống định danh và phân loại của Trichoderma vẫn chƣa hoàn chỉnh nên việc chỉ dựa đơn lẻ vào hình thái , trình tự vùng bảo tồn hoặc trình tự các vùng chức năng thì không thể định danh chính xác tên loài của chúng (Gary J. Samuels, 2004). Khóa luận tốt nghiệp này nhằm mục đích định danh tên loài với độ chính xác cao, bằng cách kết hợp kết quả định danh dựa vào hình thái với trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) mà phƣơng pháp định danh chỉ bằng hình thái không hoàn toàn chính xác. Đồng thời, phân nhóm tạo phổ hệ di truyền để thành lập dữ liệu chi tiết về quần thể nấm Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên lãnh thổ nƣớc ta. 1.2. Mục đích Định danh tên loài và phân nhóm xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam. . Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. 1.3. Yêu cầu Phục hồi 11 dòng Trichoderma từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn nấm. 1 Nuôi cấy và nhân sinh khối Trichoderma. Ly trích DNA từ sinh khối Trichoderma với độ tinh khiết cao. Thiết lập đƣợc quy trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Xác định đƣợc tên loài 11 dòng Trichoderma trên cơ sở kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng của trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) bằng phần mềm ClustalX 1.83. Phân nhóm và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma thông qua việc so sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Đánh giá đƣợc mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và phần mềm TreeView 1.6