Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen (avecinnia officinalis) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGÔ TRẦN VŨ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ NGÔ TRẦN VŨ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn Ba, Mẹ cùng ngƣời thân trong gia đình luôn quan tâm, tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập. - Các Thầy, Cô giáo trong bộ môn CNSH và các Thầy, Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt quá trình học tập 4 năm qua. - Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong suốt thời gian thực hiện đề tài. - Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hoá sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. - Các anh chị ở Ban quản lý rừng Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. - Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học. Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9 năm 2007 Sinh viên thực hiện Ngô Trần Vũ iv TÓM TẮT Ngô Trần Vũ, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007 “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẨN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là “lá phổi xanh” của Thành phố với chức năng điều hòa không khí, giảm ô nhiễm môi trƣờng xử lý nƣớc thải của Thành phố, thu nhận khí CO2 và cho ra khí O2 do hoạt động công nghiệp. Để có một chiến lƣợc lâu dài và bền vững thì việc đánh giá mức độ di truyền của quần thể này nhằm có chiến lƣợc bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Kết quả đạt đƣợc: - Thu thập 50 mẫu lá mắm đen với những đặc điểm hình thái cây khác nhau. - Xác định điều kiện bảo quản cho tối ƣu. - Hoàn thiện qui trình ly trích DNA. - Primer OPA10 và OPA5 không cho kết quả phản ứng RAPD-PCR. - Primer OPD18 cho sản phẩm nhƣng chƣa đƣợc tối ƣu. - Primer 1 cho một band kích thƣớc 400bp nên không có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền. - Bƣớc đầu khảo nghiệm primer OPAC10, xác định điều kiện tối ƣu cho primer. - Nghiên cứu đa dạng di truyền cây mắm trên primer OPAC10 của 11 mẫu thu đƣợc trung bình 5,4 band/mẫu. Tỷ lệ đồng hình 62,5% và tỷ lệ đa hình 37,5% trong đó 5 band đồng hình và 3 band đa hình. Phân tích trên phân mềm NTSYSpc 2.1, cây phân nhóm di truyền cho đồng hình khá cao. Cây phân nhóm di truyền chia làm 2 nhóm, nhóm I có hệ số đồng dạng di truyền cao 0,875-1. Nhóm 2 thu đƣợc một nhánh do không đủ điều kiện thực hiện trên nhiều mẫu. v SUMMARY Ngo Tran Vu, Nong Lam University, 9/2007. “RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avecinnia officinalis IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE AREA BY RAPD- PCR”. Supervisor: Bui Minh Tri Can Gio mangrove forest was economic and environmental value, it was very important for air-condition and waste water treatment of Ho Chi Minh City. Can Gio mangrove forest had rich and diversified floristic composition. So, studying genetic diversity of Avecinnia officinalis tree aimed conserve genetic resource gene. The obtained results were: - To collect 50 samples leaf with many tree different characteristic. - Optimized process extraction DNA for Avecinnia officinalis tree. - Optimized RAPD-PCR reaction for primer OPAC10. - To use software NTSYSpc 2.1 analyses for 11 samples. Polymorphism had 3 band and rate 37, 5%, isomorphism had 5 band and rate 62, 5%. vi MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ ........................................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................................ iv Summary ............................................................................................................................. v Mục lục ............................................................................................................................... vi Danh sách các bảng ............................................................................................................ ix Danh sách các hình ............................................................................................................. x Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. xi Chƣơng 1: GIỚI THIỆU ................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài ....................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................... 2 1.2.3. Giới hạn đề tài ......................................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................. 3 2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................ 3 2.1.2. Vai Trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .................................. 4 2.2. Một số khái niệm về đa dạng sinh học .................................................................... 5 2.2.1. Đa dạng sinh học ..................................................................................................... 5 2.2.2 Sự đa dạng di truyền ................................................................................................ 5 2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền ................................. 6 2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen ..................................... 6 2.3.1. Hình thái học ........................................................................................................... 6 2.3.2. Phân bố ................................................................................................................... 8 2.3.3. Vai trò của rừng mắm ............................................................................................. 9 2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA ......................................................................... 9 2.4.1. Các thông tin di truyền ............................................................................................ 9 2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA ............................................................................... 10 vii 2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA ..................................................................................... 11 2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .................................................................. 11 2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................................... 12 2.5. PCR (polymerase chain reaction) .......................................................................... 12 2.5.1. Nguyên tắc ............................................................................................................ 12 2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR ................................................................. 14 2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR .............................................................................. 14 2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm ........................................................................................ 14 2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học .................................. 15 2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ............................... 15 2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................................... 16 2.6.3. Chỉ thị AFLP ......................................................................................................... 17 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 20 3.1. Nội dung đề tài ...................................................................................................... 20 3.2. Thời gian thực hiện đề tài ...................................................................................... 20 3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 20 3.3.1. Mẫu mắm đen ........................................................................................................ 20 3.3.2. Hóa chất thí nghiệm .............................................................................................. 21 3.3.2.1. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA .................................................................. 21 3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA ................................................... 22 3.3.2.3. Hóa chất dùng trong định tính DNA ..................................................................... 22 3.3.2.4. Hóa chất dùng để phản ứng RAPD ....................................................................... 22 3.3.3. Trang thiết bị ......................................................................................................... 22 3.4. Phƣơng pháp ......................................................................................................... 23 3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................ 23 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 23 3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 23 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA .................................................................................... 23 3.4.4.1. Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988).............................................. 23 3.4.4.2. Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng ................................................................. 24 3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................................... 25 viii 3.4.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .............................................. 25 3.4.5. Thực hiện phản ứng RAPD-PCR .......................................................................... 26 3.4.5.1. Primer sử dụng ...................................................................................................... 26 3.4.5.2. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................... 26 3.4.6. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc ....................................................... 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 32 4.1. Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................ 32 4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền ................................................................. 33 4.2.1. Bảo quản ................................................................................................................ 33 4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền ...................................................................................... 33 4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR .............................................................................. 37 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 45 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 45 5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 45 Chƣơng 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 47 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB .................................................... 19 Bảng 3.2. Thành phần hóa chất TE 1X ............................................................................ 19 Bảng 3.3. Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu ................................................. 23 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 ................. 24 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 .......................... 24 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 ................ 25 Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 .......................... 25 Bảng 3.8. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 ................. 26 Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 .......................... 26 Bảng 3.10. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 ................. 27 Bảng 3.11. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 .......................... 27 Bảng 4.1. Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến.......................................... 34 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình dáng cây mắm đen ................................................................................... 6 Hình 2.2. Lá và hoa của cây mắm đen .............................................................................. 7 Hình 2.3. Trái của cây mắm đen ....................................................................................... 7 Hình 2.4. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR ...................................................... 12 Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP ....................................................................... 14 Hình 2.6. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật RAPD ..................................................... 15 Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ ..................................................... 32 Hình 4.2. Ly trích DNA theo qui trình Doyle và Doyle (1988) ..................................... 33 Hình 4.3. Ly trích theo qui trình Doyle và Doyle (1988) cải tiến ................................. 34 Hình 4.4. Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng ........................................................... 36 Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và OPA5 .............................................................................................................. 37 Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 ............. 38 Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 ...................... 39 Hình 4.8. Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 .................................... 39 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 ......... 40 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 .................................................... 41 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 .................................................... 41 Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ƣu ........ 42 Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen ............................................ 43 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A1, A2, A3… Mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3… AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Bp: Base pairs CNSH Công nghệ sinh học CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EB: Extraction buffer EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid GPS Global Position System L: Lƣợng Nđ: Nồng độ OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism TAE: Tris – Acetate – EDTA TE: Tris – EDTA WWF: World Wildlife Fund (quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên) 1 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Mắm là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến. [13] Trƣớc đây, ở Việt Nam cây mắm dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay, cây mắm cũng cung cấp nguyên liệu cho việc chế biến dƣợc và cung cấp sắc tố cho công nghiệp. [15] Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ phải chịu hàng ngàn tấn bom đạn cùng với đó là một lƣợng hóa chất khổng lồ đã đổ xuống đây làm cho rừng bị tàn phá khủng khiếp. Do vậy, từ năm 1978 huyện Cần Giờ đã tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn, sau 22 năm khôi phục tổ chức UNESCO đã công nhận là “khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/02/2000.[10] Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng, là khu làm sạch môi trƣờng sinh thái, môi trƣờng nƣớc và không khí Thành phố đã bị ô nhiễm nghiêm trọng. Rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là rừng phòng hộ, vừa là rừng bảo vệ Thành phố Hồ Chí Minh [2]. Vì thế việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm là vô cùng cấp thiết nhằm có chiến lƣợc quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng ta cũng có thể tìm ra chỉ thị phân tử cho cây mắm và bảo tồn nguồn gene quý. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh dƣới sự hƣớng dẫn của thầy Bùi Minh Trí chúng tôi đã thực hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avicennia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 2 1.2. Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài 1.2.1. Mục đích  Thiết lập và hoàn thiện quy trình ly trích DNA của cây mắm đen.  Tối ƣu hóa phƣơng pháp RAPD cho cây mắm đen.  Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm đen.  Tìm ra chỉ thị phân tử cho họ mắm giúp cho quá trình chọn giống. 1.2.2. Yêu cầu  Thu thập mẫu lá cây mắm đen.  Ly trích DNA mẫu lá cây mắm đen.  Hoàn thiện kỹ thuật RAPD cho cây mắm đen.  Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen.  Mô tả quan hệ di truyền của các mẫu cây mắm đen bằng phần mềm NTSYSpc. 1.2.3. Giới hạn đề tài  Đề tài chỉ nghiên cứu quần thể một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn.  Số lƣợng mẫu nghiên cứu còn ít.  Chƣa đủ điều kiện tiến hành kiểm tra tất cả các primer và các tổ hợp các primer.  Thời gian thực hiện ngắn từ 05/05/2007 đến 01/09/2007. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn 2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng n