Khóa luận khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm phytophthora capsici và các tác nhân hóa lý đến sự sinh trƣởng và khả năng tạo đột biến của cây tiêu (piper nigrum l.) nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TÔ THỊ NHÃ TRẦM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TÔ THỊ NHÃ TRẦM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY *****000***** EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Supervisor Student MSc. NGUYEN THI KIM LINH TO THI NHA TRAM Dr. LE DINH DON TERM: 2003 - 2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Lê Đình Đôn và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phƣợng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Cám ơn Thầy và các chị thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em tận tình. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Các bạn Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Bích Uyển, Nguyễn Hoàng Quân, Trần Nguyễn Mỹ Châu khoa Nông Học thực hiên đề tài ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, bạn Văn Đào, Quốc Dũng CNSH30 và Anh Khoa, Tuyết Nhung, Ngọc Lợi CNSH31 cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Sinh viên thực hiện TÔ THỊ NHÃ TRẦM iv TÓM TẮT TÔ THỊ NHÃ TRẦM, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora sp. VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Đại Học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tƣợng hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro. Những kết quả đạt đƣợc: Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Ở nồng độ dịch nấm 30 và 40 % thì mô sẹo bị chết hoàn toàn. Nồng độ 20 % tạo nhiều tế bào bất thƣờng, mô vẫn còn khả năng sống sót và ở nồng độ này cho kết quả đột biến tế bào mô nhiều hơn. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Nồng độ 10 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l IBA và 20 mg/l BA với 1 mg/l IBA cho kết quả tạo chồi cao trong đó tối ƣu nhất vẫn là BA sử dụng ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với 1 mg/l IBA. Mặt khác, nồng độ 20 mg/l IBA kết hợp với 1 mg/l BA và 1mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l TDZ lại cho kết quả đột biến cao. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu Ở liều xạ 20 Gy thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo hơn nhƣng để tạo đột biến thì ở liều xạ 40 Gy cho tỉ lệ biến dị cao hơn. Trên chồi thì liều xạ 20 Gy kích thích tạo sẹo nhiều và cả mô xốp nhƣng ở liều xạ 40 và 60 Gy cho nhiều thể đột biến hơn vì tạo đƣợc nhiều mô bất thƣờng và cấu trúc tế bào thay đổi nhiều. v SUMMARY The thesis titled “EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.)” was carried out at Biotechnology Department and Plant Protection Department – Nong Lam University, HCMC from March 2007 to August 2007 under the supervision of MSc. Nguyen Thi Kim Linh and Dr. Le Dinh Don. The thesis contents three experiments. The first experiment was “effects of Phytophthora capsici on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with Phytophthora capsici extract at 20%, 30% and 40% for 21 days. The results showed that: On the medium having Phytophthora capsici extract at 30% and 40%, the mutation ratio were highter than that on the third medium on the day 14 t after culture. However, on these two mediums all black pepper callus were died on the day 21 st after culture. The second experiment was “effects of growth regulator on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with BA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with IBA (1 mg/l); IBA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with BA (1 mg/l); and TDZ (1 mg/l, 2 mg/l) combined with IBA (1 mg/l). The results showed that: The medium supplemented with BA (10 mg/l) combined with IBA (1 mg/l) had highest shoot ratio. The medium supplemented with IBA (1 mg/l) combined with TDZ (1 mg/l) gave highest mutation ratio. The last experiment was “effects of Gamma ray on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus and shoot were treated by gamma ray at 20, 40 and 60 Gy. The results showed that: Callus formation in 20 Gy treatment was higher than that the treatments of 40 and 60 Gy. However, the mutation ratio in gamma ray at 40 and 60 Gy treatments were higher than that the treatments of 20 Gy. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm tạ ............................................................................................................ iii Tóm tắt ................................................................................................................ iv Mục lục ................................................................................................................ vi Danh sách các bảng ............................................................................................. ix Danh sách các hình .............................................................................................. x Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... xii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 3 1.3. Giới hạn của đề tài ....................................................................................... 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu ................................................................... 4 2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu ............................................................................... 4 2.1.2. Tình hình phân bố ..................................................................................... 5 2.1.3. Tình hình sản xuất tiêu thụ trên thế giới và trong nƣớc ............................ 5 2.1.3.1. Tình hình sản xuất .................................................................................. 5 2.1.3.2. Tình hình tiêu thụ ................................................................................... 6 2.1.4. Tình hình bệnh trên cây tiêu...................................................................... 9 2.1.4.1. Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra ............ 9 2.1.4.2. Bệnh tuyến trùng .................................................................................... 10 2.1.4.3. Bệnh khô đầu ngọn thối trái ................................................................... 10 2.1.4.4. Bệnh vằn lá do virus ............................................................................... 10 2.1.4.5. Các bệnh do dinh dƣỡng bất thƣờng ...................................................... 11 2.1.5. Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế ................................................... 11 2.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora capsici ..................................................... 12 2.3. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật ....................... 13 vii 2.3.1. Khái niệm bức xạ ...................................................................................... 13 2.3.2. Bức xạ gamma ........................................................................................... 14 2.3.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) .................................................................. 14 2.3.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống ...................................... 14 2.3.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa ................................................... 15 2.3.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ .................................. 16 2.3.6.1. Ngoài nƣớc ............................................................................................. 16 2.3.6.2. Trong nƣớc ............................................................................................. 17 2.4. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào tực vật .................................. 18 2.4.1. Khái niệm .................................................................................................. 18 2.4.2. Ứng dụng ................................................................................................... 18 2.4.3. Phƣơng pháp nhân phôi vô tính ................................................................ 19 2.4.3.1. Khái niệm ............................................................................................... 19 2.4.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính .......................................................... 19 2.4.3.3. Sự hình thành phôi vô tính ..................................................................... 19 2.4.3.4. Các kiểu phát sinh phôi soma ................................................................ 20 2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh truonwgr trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...... 21 2.5.1. Chất điều hòa sinh trƣởng ......................................................................... 21 2.5.2. Một số chất điều hòa sinh tƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô ........... 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................... 24 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 24 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 24 3.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy ..................................................................... 24 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng ................................................................... 24 3.3.1.2. Phòng cấy ............................................................................................... 24 3.3.1.3. Phòng cấy nấm ....................................................................................... 24 3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng .................................................................................. 24 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy .................................................................. 25 viii 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................. 25 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ .................................................................... 25 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 28 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy................................................................... 28 3.4.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 28 3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch nấn Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ............................................ 28 3.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu .......................................... 31 3.4.2.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu ......................................................... 32 3.5. Phân tích thống kê ........................................................................................ 33 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 34 4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsicci đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ........................................... 34 4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro ...................................................... 34 4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici.................................................................................................................. 34 4.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ................................................................ 42 4.3. Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo, chồi tiêu .............................................................. 51 4.3.1 Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ..................................................................................... 51 4.3.2. Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của chồi tiêu .......................................................................................... 58 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 64 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 64 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 66 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 69 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 21: Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) .................................................... 6 Bảng 2.2: Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 ................... 7 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 – 1999) ........................ 8 Bảng 2.4: Năng suất và sản lƣợng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 .............. 11 Bảng 3.1: Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ............................................................................ 30 Bảng 3.2: Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu .................................................................................... 31 Bảng 3.3: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu .................................................... 32 Bảng 3.4: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu ......................................................... 33 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo ...... 37 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy .................................................................................................................. 38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo ........... 42 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo phôi của mô sẹo tiêu ............................................................................... 43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu ................................................................................ 44 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia γ đến khả năng sống sót của mô sẹo tiêu ........................................................................................................... 51 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến khả năng tạo phôi của mô sẹo ............... 52 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ sống của chồi tiêu ...................... 58 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ tạo chồi của chồi tiêu ................ 59 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 4.1: Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D ................................................................................................. 34 Hình 4.2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy ............ 35 Hình 4.3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy ......... 36 Hình 4.4: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy .. 37 Hình 4.5: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 39 Hình 4.6: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 41 Hình 4.7: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) ......................................................... 41 Hình 4.8: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy .......................................................................................... 45 Hình 4.9: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy ............................................................................... 46 Hình 4.10: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................... 47 Hình 4.11: Mô xốp trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................................................... 48 Hình 4.12: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (độ phóng đại 40  10) ....................................