Khóa luận Khảo sát ảnh hưởng của NAA, BA và Kinetine đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh nhân nhanh giống hoa cúc Đại đóa in vitro

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP * KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KINETINE ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO Đề tài: GVHD: PGS.TS Phan Thanh Kiếm KS. Dương Thị Lan Oanh SVTH: Nguyễn Thị Thu Hiền Lớp: DH07NHA *1. Mở đầu 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả và thảo luận 4. Kết luận và đề nghị 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề - Cúc Đại Đóa là loại hoa có hình dáng và màu sắc đẹp, hoa to nên được người tiêu dùng rất ưa chuộng, đóng vai trò quan trọng trong thị trường hoa cúc. - Hoa cúc thường được nhân giống bằng cách lưu lại cây mẹ và tách mầm giá. Phương pháp này không chủ động được cây giống và dễ làm thoái hóa giống. - Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, cho hệ số nhân cao, tương đối đồng đều về mặt di truyền và sạch bệnh. * - Trong nuôi cấy mô không có môi trường nào là chuẩn tuyệt đối cần phù hợp cho sự phát triển của tất cả các tế bào. Vì vậy sự thay đổi môi trường nuôi cấy là điều cần thiết, tùy thuộc vào từng giống, loại mô nuôi cấy khác nhau - Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, BA và kinetine đến quá trình tạo mô sẹo và nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa in vitro” được thực hiện. * 1.1 Đặt vấn đề (tt) 1.2 Mục tiêu - Xác định nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho khả năng vào mẫu của cây cúc Đại Đóa. - Tìm ra sự phối hợp của BA và NAA thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo trong ống nghiệm của nụ hoa cúc Đại Đóa. - Xác định nồng độ Kinetine và NAA thích hợp cho khả năng nhân nhanh chồi và tạo rễ của cây cúc Đại Đóa. * 1.3 Yêu cầu - Đưa được mẫu vào trong ống nghiệm của giống cúc Đại Đoá - Tạo được mô sẹo, chồi và rễ cho giống cúc Đại Đóa trong ống nghiệm. - Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu. 1.4 Giới hạn đề tài Đề tài chỉ thực hiện trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 nên không thể thực hiện các thí nghiệm nhiều lần để có kết quả chính xác hơn. * 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Thời gian - địa điểm - Thời gian: 03/2011 đến 06/2011. - Địa điểm: phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam TP.HCM. * 2.2 Vật liệu thí nghiệm - Thu thập chồi thân, chồi ngọn và nụ hoa từ những cây khỏe và không bị sâu bệnh tại Phan Thiết, Bình Thuận. - Mẫu cấy trong thí nghiệm nhân nhanh chồi và tạo rễ được lấy trong chai mô. - Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường cơ bản MS (Murashige and Skoog, 1962), pH được điều chỉnh từ 5,7 – 5,8. * 2.3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu ❖Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho khả năng đưa mẫu vào phòng thí nghiệm của cây cúc Đại Đóa. ❖Thí nghiệm xử lý mẫu ở các nồng độ Hypocloride calcium: 6%, 8%, 10%, 12% trong thời gian 30 phút và 40 phút. - Số NT: 8 - Số LLL: 3 - Số mẫu/1 LLL: 15 - Tổng số mẫu thí nghiệm: 360 mẫu * *Mẫu rửa sạch dưới vòi nước Rửa xà bông Rửa sạch dưới vòi nước Tủ cấy vô trùng, rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng Chất khử trùng Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Quy trình khử trùng Cấy vào môi trường khoáng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi - Tỷ lệ nhiễm (%) = (số mẫu nhiễm/tổng số mẫu đưa vào) x 100 - Tỷ lệ chết (%) = (tổng số mẫu chết/tổng số mẫu đưa vào) x 100 - Tỷ lệ mẫu sạch (sống) (%) = (số mẫu thu được/tổng số mẫu đưa vào) x 100 * ❖Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của nụ hoa cúc Đại Đóa in vitro - Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên - Yếu tố A: nồng độ của NAA (0 mg/l, 0,2 mg/l, 0,5 mg/l ), ký hiệu A0, A1, A2 - Yếu tố B: nồng độ của BA (0 mg/l, 1 mg/l, 2mg/l, 3 mg/l) được ký hiệu từ B0, B1, B2, B3 * *Phối hợp hai yếu tố Yếu tố B B0 B1 B2 B3 Yếu tố A A0 A0B0 A0B1 A0B2 A0B3 (NT1- ĐC) (NT2) (NT3) (NT4) A1 A1B0 A1B1 A1B2 A1B3 (NT5) (NT6) (NT7) (NT8) A2 A2B0 A2B1 A2B2 A2B3 (NT9) (NT10) (NT11) (NT12) Tổng số nghiệm thức: 12 - Số LLL: 3 - Số bình/LLL: 3 - Số mẫu/bình: 3 - Tổng số mẫu trong thí nghiệm: 324 - Tỷ lệ mô sẹo được hình thành (%) = tổng số mẫu mô sẹo hình thành/tổng số mẫu đem cấy x 100 (giai đoạn 45 NSC) - Đường kính mô sẹo (cm): đo đường kính dài nhất của mô sẹo (45NSC) - Mô tả đặc điểm hình thái mô sẹo hình thành. Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi ❖Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi của giống cúc Đại Đóa in vitro ❖Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. - NT1 (Đ/C): MTN + 0mg/l kinetine - NT2: MTN + 1 mg/l kinetine - NT3: MTN + 2 mg/l kinetine - NT4: MTN + 3 mg/l kinetine - NT5: MTN + 4 mg/l kinetine ❖MTN: Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar * - Tổng NT: 5 - LLL: 3 - Số bình/LLL: 1 - Số mẫu/bình: 30 - Tổng số mẫu dùng trong TN: 450 - Mẫu thí nghiệm: đoạn thân mang một mắt ngủ * Thí nghiệm 3 (tt) - Tỷ lệ tạo chồi (%): (đếm toàn bộ số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100 - Số chồi/ mẫu: đếm toàn bộ số chồi/mẫu - Chiều cao chồi: đo từ gốc đến đỉnh đọt của chồi cao nhất - Hệ số nhân = tổng số mẫu thu được sau khi nhân/tổng số mẫu cấy ban đầu - Các chỉ tiêu được theo dõi ở 35 NSC * Các chỉ tiêu – phương pháp theo dõi ❖Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây cúc Đại Đóa in vitro ❖Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. - TN1 (Đ/C): MTN + 0 mg/l NAA - TN2: MTN + 1 mg/l NAA - TN3: MTN + 1,5 mg/l NAA - TN4: MTN + 2 mg/l NAA - TN5: MTN + 2,5 mg/l NAA ❖MTN: Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar +0,1 g/l than hoạt tính * - Tổng số NT: 5 - Số LLL: 3 - Số bình/ LLL: 1 - Số mẫu/ bình: 25 - Tổng số mẫu dùng trong TN: 375 * Thí nghiệm 4 (tt) - Tỷ lệ ra rễ (%) = (tổng số cây ra rễ/tổng số mẫu cấy) x 100 - Số rễ/cây: đếm toàn bộ số rễ/cây - Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ dài nhất - Mô tả đặc điểm hình thái của rễ tạo thành. - Các chỉ tiêu được theo dõi ở 25 NSC * Chỉ tiêu - phương pháp theo dõi 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập được tính toán trên phần mềm Excel, việc xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm SAS 9.13. * 3. Kết quả và thảo luận * *❖Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho khả năng đưa mẫu vào phòng thí nghiệm của cây cúc Đại Đóa. Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm, sống, chết (%) của mẫu Cúc Đại Đoá 10 NSC Nồng độ Hypochlorite Calcium (%) Thời gian khử trùng (phút) 30 40 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) 6 100 - - 87 13 0 8 60 24 16 51 29 20 10 27 56 17 22 38 40 12 20 27 53 16 18 67 • Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của nụ hoa cúc Đại Đóa in vitro * Bảng 3.2: Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến quá trình hình thành mô sẹo NAA (mg/l) BA (mg/l) TL hình thành mô sẹo (%) ĐK mô sẹo (cm) ngày hình thành(ngày) Hình thái mô sẹo 0 0 0,0f 0,00f - - 0 1 14,8e 0,57e 20 - 25 nâu đen 0 2 25,9de 1,07c 25 vàng nâu 0 3 40,7d 0,77de 20 - 30 vàng nâu 0,2 0 0,0f 0,00f - - 0,2 1 63,0c 0,80cde 20 - 24 trắng xanh, phát triển chậm 0,2 2 100,0a 2,30a 10 - 13 trắng xanh, phát triển nhanh 0,2 3 100,0a 1,93a 10 - 13 vàng nâu 0,5 0 0,0f 0,00f - - 0,5 1 85,2b 0,93dc 10 - 13 trắng xanh, phát triển hệ rễ 0,5 2 100.0a 2,07a 10 - 13 trắng xanh, phát triển hệ rễ 0,5 3 100,0a 1,57b 10 - 13 vàng nâu, phát triển hệ rễ CV (%) 10,71 F(NAA*BA) 27,7** 13,88** Ghi chú: : kí tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột, **: có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,01. NAA ( g/l) BA ( g/l) TL hình thành mô sẹo (%) ĐK mô sẹo (cm) ngày hình thành(ngày) ình thái ô sẹo 0 0 0,0f 0,00f - - 0 1 14,8e 0,57e 20 - 25 nâu đen 0 2 25,9de 1,07c 25 vàng nâu 0 3 40,7d 0,77de 20 - 30 vàng nâu 0,2 0 0,0f 0,00f - - 0,2 1 63,0c 0,80cde 20 - 24 trắng xanh, phát triển chậm 0,2 2 100,0a 2,30a 10 - 13 trắng xanh, phát triển nhanh 0,2 3 100,0a 1,93a 10 - 13 vàng nâu 0,5 0 0,0f 0,00f - - 0,5 1 85,2b 0,93dc 10 - 13 trắng xanh, phát triển hệ rễ 0,5 2 100.0a 2,07a 10 - 13 trắng xanh, phát triển hệ rễ 0,5 3 100,0a 1,57b 10 - 13 vàng nâu, phát triển hệ rễ CV (%) 10,71 F(NAA*BA) 27,7** 13,88** *Hình 4.1: Mô sẹo được hình thành từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45 NSC A): MT bổ sung 2 mg/l BA; B): MT bổ sung 0,2 mg/l NAA; C): MT bổ sung 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BA; D): MT bổ sung 0,2 mg/l NAA + 2 mg/l BA; E): MT bổ sung 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA; F): MT bổ sung 0,2 mg/l NAA + 3 mg/l BA.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi của giống cúc Đại Đóa in vitro • Ghi chú: : kí tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột, **: có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,01. * Bảng 3.3: Ảnh hưởng của kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi cúc Đại Đóa 35 NSC NT Kinitine (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu cấy (chồi) Chiều cao chồi (cm) HSN 1(Đ/C) 0 100 1,0d 4,65a 2,9c 2 1 100 1,0d 4,73a 3,2b 3 2 100 3,1a 4,00b 4,4a 4 3 100 2,8b 3,34c 2,8c 5 4 100 2,1c 1,75d 2,3d CV (%) Ftính 4,43 372,5** 3,91 215,3** 3,04 205,7** *Hình 3.2: Ảnh hưởng của kinitine đến quá trình nhân nhanh chồi cúc Đại Đóa 35 NSC Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA đến năng ra rễ của hoa cúc Đại Đóa 25 NSC • Ghi chú: Kí tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột, **: có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,01.; ns: không có sự khác biệt trong thống kê.* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây cúc Đại Đóa in vitro NT NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) 1(Đ/C) 0 98,7 3,8d 6,4a 2 0,5 98,7 4,8c 6,1a 3 1 100 5,2bc 6,2a 4 1,5 100 5,9a 5,0 b 5 2 100 5,4b 4.5b 6 2,5 98,7 4,2d 3.5c CV (%) Ftính 1,64 0,6ns 4,37 42,9** 5,43 47,3** Hình 3.3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình ra rễ của cây cúc Đại Đóa 25 NSC * 4. Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận - Dung dịch Hypocloride calcium 10% xử lý mẫu trong 30 phút phù hợp cho việc đưa mẫu vào phòng thí nghiệm. - Môi trường MS được bổ sung 0,2 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l BA là môi trường phù hợp để tạo mô sẹo nụ hoa cúc Đại Đóa * - Môi trường MS + 2 mg/l kinitine là môi trường thích hợp cho nhân chồi cúc Đại Đóa in vitro - Môi trường MS + 0,1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l NAA là môi trường phù hợp để ra rễ cúc Đại Đóa. * 4.1 Đề nghị - Sử dụng môi trường có bổ sung 0,2 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l BA trong thí nghiệm tạo mô sẹo của nụ hoa cúc Đại Đóa. - Tiếp tục nghiên cứu các nồng độ kinitine ở bước nhảy 0,5 mg/l trong thí nghiệm nhân chồi để tìm ra nồng độ phù hợp nhất trong nhân chồi hoa cúc Đại Đóa in vitro. * Cảm ơn sự quan tâm theo dõi của Thầy Cô và các bạn * *Đường kính mô sẹo (cm) Yếu tố A (NAA, mg/l) Trung bình B0 0,2 0,5 Yếu tố B (BA,mg/l) 0 0,00f 0,00f 0,00f 0,00D (0,07) (0,07) (0,07) 0,07 1 0,57e 0,80cde 0,93dc 0,77C (1,03) (1,14) (1,20) (1,12) 2 1,07c 2,30a 2,07a 1,81A (1,25) (1,67) (1,60) (1,52) 3 0,77de 1,93a 1,57b 1,42B (1,12) (1,56) (1,44) (1,37) Trung bình A 0,60b 1,26a 1,14a 1,03 1,27 1,26 CV = 4,57% F(A) = 70,66** F(B) = 384,59** F(A*B) = 13,88** Bảng 4.3: Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến đường kính mô sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45NSC Ghi chú: Các ký tự trung bình có cùng ký tự không có sự khác biệt trong thống kê; **: có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,0;.các số liệu đã được chuyển đổi sang √(x + 0,5). *Tỷ lệ tạo mô sẹo Yếu tố A ( NAA (mg/l)) Trung bình B0 0,2 0,5 Yếu tố B (BA (mg/l) 0 0,0f 0,0f 0,0f 0,0C (0,02) (0,02) (0,02) (0,02) 1 14,8e 63,0 85,2b 54,3B (0,39) (0,92) (1,24) (0,85) 2 25,9de 100,0a 100,0a 75,3A (1,55) (1,21) (1,55) (1,21) 3 40,7d 100,0a 100,0a 80,2A (1,55) (1,27) (1,55) (1,27) Trung bình A 20,4B 65,8A 64,6A (0,41) (1,01) (1,09) CV = 10,71% F(A) = 208.2** F(B) = 373,1** F(A*B) = 27,7** Bảng 4.2: Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến tỷ lệ hình thành mô sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45NSC Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng ký tự không có sự khác biệt trong thống kê; **: có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở mức α = 0,01;.các số liệu đã được chuyển đổi sang arcsin√% .