Khóa luận Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002-2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8/2006 2 LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng.  Ths. Vƣơng thị Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  Cô Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận và thực hiện đề tài.  Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm.  Các Anh Chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.  Các bạn bè của lớp công nghệ sinh học khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.  Các bạn bè ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện Nguyễn nhƣ Hiến 3 TÓM TẮT  Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA” thực hiện bởi sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SH- Khoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới sự hƣớng dẫn bởi Th.s Vƣơng Thị Việt Hoa.  Thời gian và địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006, Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderm. sp gồm 3 chủng D13, D14, D16. Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme (cellulase, amylase…). Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực hệ enzyme amylase của các chủng này (đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học.  Những kết quả đạt đƣợc. Chọn ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải cao. Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH). 4 MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ....................................................................................................................... 2 Tóm tắt ............................................................................................................................. 3 Mục lục ........................................................................................................................... 4 Danh sách các hình .......................................................................................................... 6 ........................................................................................................................................... Danh sách các bảng ........................................................................................................ 7 Danh sách các biểu đồ .................................................................................................... 8 I. MỞ ĐẦU. ..................................................................................................................... 9 II. Tổng quan tài liệu. .................................................................................................... 10 2.1. Giới thiệu về tinh bột .............................................................................................. 10 2.2. Quá trình thuỷ phân tinh bột. .................................................................................. 10 2.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma.............................................................................. 17 2.3.1. Phân loại-Đặc điểm về hình thái. ........................................................................ 17 2.3.2. Đặc điểm về sinh lý, sinh hoá. ............................................................................. 18 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................................... 19 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 19 3.2. Phƣơng pháp. .......................................................................................................... 21 3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải ...................................................................... 21 3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy. ................................................................................................ 22 3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase ......................................... 22 3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối vối enzyme amylase. .................. 23 3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase ........... 24 3.2.6. Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ). 24 5 IV. KẾT QUẢ................................................................................................................ 28 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ..................................... 28 4.2. Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải. ........................................................................................... 29 4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase. ......................................................... 31 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng D13 ................................................................................................................................ 39 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13. ... 41 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 43 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 45 6 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc bậc 3 của Enzyme Amylase. ............................................................ 14 Hình 2.2. Quá trình thủy phân Amylose........................................................................ 15 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen ............................................ 16 Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. ...................................... 18 Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển trên môi trƣờng PGA ........ 18 7 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Dung dịch đệm Mc Hvaice. .......................................................................... 23 Bảng 3.2. Các dung dịch đệm pH 3 – 6,5. ..................................................................... 23 Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase ..................................................... 26 Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột........................................................................... 26 Bảng 3.5. Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn. ............................................................ 27 Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ............................. 28 Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ...................................... 29 Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ...................................... 30 Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn. ........................................................... 31 Bảng 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 32 Bảng 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. .............. 34 Bảng 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 36 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 .............. 39 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ..................... 41 8 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ..................................... 29 Đồ thị 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ..................................... 30 Đồ thị 4.3. Đƣờng chuẩn. .............................................................................................. 31 Đồ thị 4.4. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy. ............ 33 Đồ thị 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. ............ 35 Đồ thị 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy. ............ 37 Đồ thị 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của 3 chủng D13, D14, D16. ............................. 38 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ........... 40 Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. .................... 42 9 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng. Mặt khác, các quy định trong sản xuất thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm tăng trƣởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi. Một phƣơng pháp phổ biến đang đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng sự tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dƣỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dƣỡng . Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm Trichoderma. sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và đƣợc sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trƣờng… đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học. Enzyme amylase là một enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy giải liên kết glucosid trong tinh bột. Enzyme amylase cũng đã đƣợc nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng đƣợc phân lập và tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tƣơng …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae …). Góp phần vào định hƣớng nêu trên, đƣợc sự ủng hộ của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và khoa Công Nghệ Thực Phẩm chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma. sp” 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI. 1. Chọn chủng Trichoderma sp. có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao 2. Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma. 10 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngô: 65-75%; khoai tây: 12-20% …) Trong thực vật tinh bột tồn tại dƣới dạng hạt tinh bột, đƣờng kính 0,002-0,15 mm. Các loại thực vật khác nhau chứa các hạt tinh bột có hình dạng và kích thƣớc khác nhau. Tinh bột đƣợc tổng hợp ở thực vật gồm 2 thành phần chủ yếu:  Amylose - polysaccharide tan trong nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod. Amylose có cấu tạo hoá học là chuỗi dài không phân nhánh của gốc α – D - glucopyranose nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside. Phân tử Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn mỗi vòng chứa 6 phân tử glucose.  Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đƣờng đơn nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside . Amylopectin cho màu tím đỏ với Iod. Trọng lƣợng phân tử thƣờng là vài triệu. Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin. 2.2. Quá trình thủy phân tinh bột 2.2.1. Giới thiệu về enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein. Nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ nhƣ ở các phản ứng thông thƣờng. Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro). a) Tính chất hóa - lý. do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính chất nhƣ các protein.  Khi hòa tan trong nƣớc, enzyme cho một dung dịch keo với những tính chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…  Enzyme có tính lƣỡng cực. 11  Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện. tại điểm này, chúng có độ hòa tan thấp nhất.  Enzyme không chịu đƣợc nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác.  Enzyme cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein nhƣ các enzyme tiêu hóa( pepsin, tripsin…). b) Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme.  Vận tốc ban đầu của phản ứng. Nếu khảo sát lƣợng cơ chất đƣợc biến đổi theo thời gian, ngƣời ta nhận thấy rằng đƣờng cong biểu diễn ban đầu là một đoạn thẳng với độ dốc không đổi, sau đó đƣờng biểu diễn bị uốn cong cho thấy lƣợng cơ chất bị biến đổi giảm đi, nghĩa là tốc độ phản ứng giảm đi và cuối cùng bị triệt tiêu khi tất cả các chất đều đƣợc biến đổi. Vo = tgαo Trong đó: Vo là vận tốc ban đầu. αo là góc hợp bởi đƣờng biểu diễn và đƣờng nằm ngang ở thời điểm to.  Nồng độ enzyme.. Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme..  Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và nồng độ cơ chất [S] thay đổi, ngƣời ta nhận thấy đầu tiên vận tốc phản ứng gia tăng nhanh chóng. Nhƣng khi [S] tiếp tục tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với nồng độ [S] cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận với giá trị cực đại Vmax.  Ảnh hƣởng nhiệt độ Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng hai hiện tƣợng khác nhau. + Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40oC), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng (do nhiệt cung cấp năng lƣợng cho phản ứng). + Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme), vận tốc phản ứng giảm xuống do sự biến tính của protein. Đa số các enzyme mất hoạt tính 12 ở 80 – 100 oC. Khoảng nhiệt độ tối ƣu là khoảng nhiệt độ mà tại đó enzyme đạt hoạt tính cao nhất. Đa số các enzyme có nguồn gốc động vật nhiệt độ tối ƣu vào khoảng 40 – 50 oC, và các enzyme thực vật khoảng 50 – 60 oC.  Ảnh hƣởng của pH. Sự thay đổi pH gây nên: + Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptide của enzyme. + Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành phức enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dƣới dạng ion. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme thay đổi theo pH của môi trƣờng và ngƣời ta có xác định giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng và thông thƣờng ngoài giới hạn pH tối ƣu khoảng hai đơn vị thì vận tốc phản ứng không đáng kể (thấp hơn ít nhất 100 lần).  Tác nhân ức chế enzyme (inhibitor). - Ức chế thuận nghịch: + Ức chế cạnh tranh (compertitive inhibitor) tâm xúc tác enzyme với cơ chất. Chất ức chế cạnh tranh có hình dạng giống cơ chất do vậy dễ dàng tạo phức EI ngăn cản tạo phức ES. Cách khắc phục: tăng nồng độ cơ chất. + Ức chế không cạnh tranh: Ức chế không cạnh tranh chung (noncompertitive inhibitor). Chất ức chế gắn lên vị trí sát tâm hoạt động enzyme, không ngăn cản cơ chất gắn lên tâm hoạt động. 13 Ức chế cạnh tranh riêng (uncompertitive inhibitor). Chất ức chế gắn lên vị trí tâm hoạt động enzyme trong phức ES tạo thành, mà không gắn lên enzyme tự do. - Ức chế không thuận nghịch: xảy ra khi chất ức chế tạo liên kết hóa trị khá bền vững với enzyme. Ngoài ra trong nhóm này còn có một số chất ức chế khá đặc biệt, bình thƣờng chúng không hoạt động và chỉ hoạt động khi đƣợc gắn hóa trị với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng đƣợc gọi là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor). 2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate). Enzyme amylase bao gồm: α-amylase, β- amylase, R-Enzyme (α-1,6-glycosidase), Amyloglycosidase… Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lƣợng phân tử, hoạt tính, điều kiện phản ứng khác nhau.  α –amylase từ vi khuẩn (chủ yếu từ Bacillus subtilis var amyloliquefaciens và var amylosacchariticus). MW : 49000 Da ( theo Fisher và Stein – 1960) Hoạt tính: 4x105 SKB/g protein enzyme Điều kiện phản ứng: Top : 65-70 o C pHop : 6,5-7,5  α –amylase từ nấm Aspergillus orizae MW : 51000 Da Hoạt tính: 50000 SKB/g protein enzyme Điều kiện phản ứng: Top : 50-60 o C pHop: 5  α –amylase từ mầm mạch. MW: 42000-54000 Da Điều kiện phản ứng: Top: 70 o C 14 pHop: 5,5 (đơn vị SKB là lƣợng amylase thủy phân 1g dextrin giới hạn dạng β đến điểm mất màu với Iod trong thời gian 1 giờ, điều kiện chuẩn). Hình 2.1: cấu trúc bậc 3 của α - amylase. 2.2.3 Quá trình thủy phân tinh bột Enzyme Amylase cắt tinh bột tạo Dextrin và đƣờng.  α –amylase cắt các liên kết glycoside nằm bên trong phân tử tinh bột.  β- amylase cắt từng cặp đƣờng đôi (maltose) từ phía đầu của mạch carbohydrate.  R-Enzime còn gọi là α-1,6-glycosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất pháp mạch nhánh.  Ngoài ra Enzyme Amyloglycosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đƣờng đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate. 15 Hình 2.2: Quá trình thủy phân Amylose. 16 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen. 17 2.3. Giới thiệu về Trichoderma Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma nhƣ sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1968 ), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma đƣợc phân thành 5 nhóm: Trichoderma. Longibrachiatum. Saturnisporum. Pachybasium. Hypocreanum. Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dƣới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum không tìm thấy hình thức teleomorph . 2.3.1. Đặc điểm hình thái Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty . Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20OC. 18 Hình 2.4: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. 2.3.2. Đặ