Khóa luận Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phủ cây Drosera burmanni vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn . Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , ngƣời đa ̃tâṇ tình hƣớng dâñ và taọ moị điều kiêṇ để em thƣc̣ hiêṇ khóa luâṇ này. Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả. Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam, ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ ích. Em cảm ơn anh Điền , anh Hoàng , anh Cƣờng và các anh chi ̣ phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sin h hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , ĐH Nông Lâm TP . HCM. Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em thƣc̣ tâp̣. Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đôṇg viên tôi nhƣ̃ng lúc găp̣ khó khăn trong đề tài. Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các baṇ thân đa ̃cùng tôi chia sẻ tất cả nhƣ̃ng nỗi buồn vui suốt bốn năm đaị hoc̣. Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tƣởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuôc̣ sống. Tháng 9/2007 Hoàng Thị Thu iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cƣ́u “Khảo sát khả năng ƣ́ng duṇg ky ̃thuâṭ nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâṇ hơp̣ chất anthraquinone” đƣơc̣ tiến hành taị trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên , Đaị hoc̣ Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sinh hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Kết quả thu đƣơc̣: - Mô seọ tƣ̀ mâũ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơc̣ hình thành trên môi trƣờng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đƣờng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điều kiêṇ ủ tối. - Các kỹ thuật sắc ký cột , sắc ký bản mỏng đƣơc̣ sƣ̉ duṇg nhằm cô lâp̣ và ly trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơp̣ chất này đ ƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác nhau của cây Drosera burmanni Vahl. - Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinone bằng kỹ thuâṭ HPLC cho thấy : hàm lƣơṇg anthraquinone trong rê ̃là 3,03% so với troṇg lƣơṇg khô, nhiều hơn trong thân lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắc tố đỏ là 0,78%; trong sinh khối huyền phù tế bào là 0,02% ( so với troṇg lƣơṇg tƣơi ), trong khi không thấy có sƣ ̣hiêṇ diêṇ của anthraquinone trong dic̣h môi trƣờng . v SUMMARY The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology, University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007. Results: - Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l), 2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to 5,8 before autoclaving. - Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was used as authentic sample for HPLC technique. - Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone, larger than 2,78% in leaves. - Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW, compared with 2,78% DW in green-leaf trees. - Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been found in spent medium. Ho Chi Minh city, September, 2007. Hoang Thi Thu vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tƣạ ..................................................................................................................... .i Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục luc̣ ..................................................................................................................... vi Danh sách các chƣ̃ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ..................................................................................................... x Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3 2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3 2.1.3. Mô tả hình thái ............................................................................................... 4 2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6 2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7 2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11 2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12 2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp ........................................................................ 14 2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................ 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19 2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù .............................................................................. 19 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào ......................................................................... 19 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19 vii 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù ........................................................................................................... 22 2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy ..................................................................... 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22 2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24 2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28 Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................ 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31 3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31 3.1.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37 3.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38 3.2.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 39 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40 3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp......................................... 40 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41 viii 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone ........................................................................... 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45 3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................. 45 Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù ........................................................... 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56 4.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơṇg hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ...................................................... 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-benzylaminopurine CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên) ctv : cộng tác viên HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ao áp) IAA : 3-indolyl-acetic acid IBA : 3-indolebutyric acid MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : naphthalene acetic acid PVP : poly vinyl pyrrolidone TCL : Thin Cell Layer (Lớp mỏng tế bào) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) x DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4 Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4 Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5 Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. ........................................................... 7 Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10 Hình 2.6. Môṭ số loaị Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15 Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc ................... 21 Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21 Hình 2.9. Sắc ký côṭ ............................................................................................... 24 Hình 2.10. Mô hình sắc ký nhanh côṭ khô ............................................................. 26 Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ...................................