Khóa luận Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa (catharanthus roseus) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN Thành phố Hồ Chí Minh 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN ThS. NGUYỄN VĂN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh 2007 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cƣờng đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Phan Phƣớc Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - KS. Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Bạn Hoàng Thị Thu cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2007 Cao Thị Thanh Loan iv TÓM TẮT CAO THỊ THANH LOAN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA HORMONE TĂNG TRƢỞNG AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO” Hội đồng hướng dẫn: TS. Trần Thị Lệ Minh Th.S Nguyễn Văn Cường Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa. Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học. Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày. Bên cạnh đó thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ; xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử. Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro như catharanthine, vindoline… Những kết quả thu được: Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5 mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân v hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l. Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l. vi SUMMARY “STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO” The effect of different growth regulator on growth and production of indol alkaloid were studied in Catharanthus roseus. Shoots were grown in MS solid medium containing different concentrations of growth regulators. Extracted alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for determination of indol alkaloid quantities. The growth regulators on the experiment were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days. The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots. The qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most. Analyses by CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium adding NAA 0,5 mg/l. vii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................. vii Danh sách các bảng ............................................................................................. xi Danh sách các hình và sơ đồ............................................................................... xiii Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. xv CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ....................................................................... 3 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ......................................................... 3 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ..................................................................... 4 2.2. Alkaloid ......................................................................................................... 4 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus ............ 7 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa ......................................................... 7 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa ................... 8 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa .......................................... 9 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................. 13 2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa............................................... 13 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh .............. 14 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp ............................. 15 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 15 viii 2.4.2. Nguồn đạm .................................................................................................. 16 2.4.3. Nguồn cacbon .............................................................................................. 16 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen .............................................................. 16 2.4.5. Các chất khác .............................................................................................. 16 2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid ........................................................ 17 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất ...................................................................... 17 2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ .............................................. 17 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước ..................... 18 2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid ............................ 18 2.6.1. Phản ứng tạo tủa .......................................................................................... 19 2.6.2. Phản ứng tạo màu ........................................................................................ 19 2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid....................................................... 20 2.7.1. Phương pháp cân ......................................................................................... 20 2.7.2. Phương pháp trung hòa .............................................................................. 20 2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan ............................................... 21 2.7.4. Phương pháp so màu ................................................................................... 21 2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại .......................................... 22 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp ..................................................................... 22 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản ...................................................................... 22 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp ............... 23 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao .................................................. 24 2.8.2. Xử lý với Elicitor ........................................................................................ 24 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học .............................................. 24 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất .................................................................................. 24 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học ................................................................................. 25 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26 ix 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro ................................................. 26 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 26 3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 26 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 26 3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ............................................................... 26 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ......................... 27 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .......................................... 27 3.3.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 29 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA .......................................................... 29 3.4.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra ............................................................................................ 29 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 29 3.4.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 30 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ................................................ 30 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................................................................................. 31 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo ................................... 31 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE ......................................... 32 3.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 32 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa ................................ 32 x 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa ........................................ 32 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE ................................ 34 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 56 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 58 PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây .................. 13 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 27 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .............................................................. 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 28 Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l..................................... 35 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 38 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ............................................................................ 41 Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 43 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 46 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE ................................... 50 N2 N3 N1 I2 xii Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE .................. 53 Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy ........................................... 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid .................... 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa ............................................................................................ 7 Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa ........................................................................... 8 Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine ................................................... 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline .......................................................... 10 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine ................................. 11 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất ................................................................................ 12 Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy ....................................... 39 Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày .............................................. 42 Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ..................................... 42 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ............................. 44 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .................................. 45 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ........................................................ 46 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .......................................................... 47 Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l ............................ 48 Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi ................................................................................ 49 Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô ................................................................................ 50 xiv Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. ................................................................... 52 Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi ..................................................................... 52 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi ................................ 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô ................................ 34 Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 ....