Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây xuân hoa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ sinh thành, đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người. Em xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban chủ nhiệm, Thầy và Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Em xin trân trọng biết ơn: - TS. Phan Phước Hiền. - ThS. Mai Đình Trị. đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quí báu cho luận văn. - Cô Nguyễn Thị Huyên, phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Khoa Công Nghệ Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. - Ths. Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh Trần Kim Hùng Nguyên iv TÓM TẮT TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)". Đề tài được tiến hành tại - Phòng Hóa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và Phòng Hóa Lý-Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. - Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Khoa Công Nghệ Môi Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN PHƯỚC HIỀN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Nhằm khẳng định một phần những công dụng dân gian trên một cách có khoa học và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Những kết quả đạt được: - Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin… - Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung môi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol. Sau khi chiết tách tiến hành loại dung môi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung môi. - Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Kết quả thu cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là MICSalmonella = 340 μg/ml MICE. coli = 330 μg/ml - Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol. v MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tóm tắt ...................................................................................................................... iv Mục lục ...................................................................................................................... v Danh sách các từ viết tắt ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .................................................................................................... x Danh sách các hình .................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Phần I. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) ................................................ 3 2.1.1.Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 3 2.1.3.Thành phần hoá học ................................................................................... 4 2.1.4.Tính chất dược lý ....................................................................................... 4 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian ........................................................... 4 2.1.4.2. Tác dụng sinh học ......................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn đường ruột ............................................................................................ 9 2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột ....................................................... 9 2.2.1.1. Định nghĩa ..................................................................................... 9 2.2.1.2. Hình thể ......................................................................................... 9 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy .......................................................................... 9 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học ............................................................. 9 2.2.1.5. Sức đề kháng ............................................................................... 10 vi 2.2.1.6. Độc tố .......................................................................................... 10 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ............................................................... 11 2.2.1.8. Phân loại...................................................................................... 12 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 13 2.3. Salmonella ......................................................................................................... 13 2.3.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 14 2.3.1.1. Hình thái...................................................................................... 14 2.3.1.2. Tính chất nuối cấy ....................................................................... 14 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học .......................................................... 15 2.3.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 15 2.3.1.5. Độc tố .......................................................................................... 15 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 15 2.3.1.7. Phân loại...................................................................................... 16 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 16 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 16 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thương hàn ...................................................... 17 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn ........................................... 18 2.3.3. Miễn dịch ................................................................................................ 18 2.3.4. Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thương hàn ................................................ 18 2.3.4.1 Cấy máu ....................................................................................... 18 2.3.4.2. Cấy phân ..................................................................................... 19 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp .................................................................. 19 2.3.5. Phòng bệnh .............................................................................................. 20 2.3.5.1. Phương pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu ....................... 20 2.3.5.2. Phương pháp phòng bệnh đặc hiệu ............................................. 20 2.3.6. Điều trị .................................................................................................... 20 2.4. Escherichia coli ................................................................................................ 21 2.4.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 21 2.4.1.1. Hình thái...................................................................................... 21 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy ....................................................................... 21 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh ....................................................................... 22 vii 2.4.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 22 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 22 2.4.1.6. Phân loại...................................................................................... 23 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 23 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật ............................................................................ 24 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp ................................................................... 24 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp .................................................................. 24 2.4.4. Phòng bệnh .............................................................................................. 24 2.4.5. Chữa bệnh ............................................................................................... 24 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 26 3.1. Vật liệu .............................................................................................................. 26 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................... 26 3.1.1.1. Nguyên liệu ................................................................................. 26 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................... 26 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết ....................................................................... 26 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm ........................................ 27 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 28 3.2.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................... 28 3.2.2. Xác định độ ẩm ...................................................................................... 28 3.2.3. Xác định tro toàn phần ............................................................................ 28 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật .................................................... 28 3.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 28 3.3.2. Cách tiến hành ......................................................................................... 28 3.4. Phương pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa ........................ 34 3.4.1. Điều chế các loại cao ............................................................................. 34 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa ........................................................... 34 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 34 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol ............................................................... 34 3.4.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 34 3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa ........................................ 36 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập được ...................................... 36 viii 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ................................................................... 36 3.5.1. Chuẩn bị môi trường .............................................................................. 36 3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa ......................................................................... 36 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục ........................................................... 38 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy ................................................................................... 38 3.5.5. Thử nghiệm ............................................................................................ 39 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 4.1. Nguyên liệu........................................................................................................ 41 4.1.1. Xác định độ ẩm ....................................................................................... 41 4.1.2. Xác định độ tro ........................................................................................ 41 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ........................................................... 41 4.3. Cô lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa .......................................................... 43 4.3.1. Điều chế các loại cao............................................................................... 43 4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa ............................................................. 43 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 43 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol ............................................................... 43 4.3.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 43 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa ............................................. 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S ............................................... 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh ............................................................................................ 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................... 51 I. Kết luận ................................................................................................................ 51 5.1. Khảo sát thành phần hóa học ............................................................................. 51 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn .................................................................. 51 II. Đề nghị ......................................................................................................................... 51 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S ...................................................................... 52 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S........................................................................ 53 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S ............................................................. 54 Phụ lục 4: Phổ 13C của hợp chất S ...................................................................... 55 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol .......... 56 ix CÁC TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer. IR : Infrared, hồng ngoại. MS : Mass Spectrometry, khối phổ. J : Hằng số ghép cặp. s : Singlet, mũi đơn. d : Doublet, mũi đôi. t : Triplet, mũi ba. q : Quartet, mũi bốn. m : Multiplet, mũi đa. SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase. SGPT : Glutamic pyruvic transaminase. LD50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể. x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa ....................... 4 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa ........................................................................ 6 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng .................................................................................. 7 Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng .............................................................................. 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng ................................................................................ 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol .................................... 8 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa ........................................................................................... 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi .................................................. 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) ................................. 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml .............................................................................................. 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl3 trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml ............................................................................................. 50 Bảng 4.6: Kết luận ........................................................................................................ 50 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Cây Xuân Hoa ................................................................................................ 3 Hình 2.2: Salmonella typhimurium............................................................................... 14 Hình 2.3: Escherichia coli ...................................................................................