Khóa luận Nghiên cứu bào chế Liposome Doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng Ethanol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn Ths. Nguyễn Văn Lâm Nơi thực hiện Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội và bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS. Nguyễn Văn Lâm Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. 6 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ............................................................................... 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ..................................................................... 8 ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2 1.1. Doxorubicin ...................................................................................................... 2 1.1.1. Đại cương về doxorubicin .......................................................................... 2 1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường ........................................... 3 1.2. Đại cương về liposome ..................................................................................... 4 1.2.1. Khái niệm ................................................................................................... 4 1.2.2.1. Ưu điểm ................................................................................................ 4 1.2.2.2. Nhược điểm .......................................................................................... 5 1.2.3. Phân loại .................................................................................................... 6 1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp .................................................................... 6 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ ............................................................................ 6 1.2.4. Phương pháp bào chế ................................................................................. 7 1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn ............................................................... 7 1.2.4.2. Phương pháp Bangham ....................................................................... 8 1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham ..................................................... 8 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol ................................ 9 1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin .................................................. 11 1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới ....................... 11 1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam ...................... 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu .............. 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 14 2.1.2. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 14 2.1.3. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 15 2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin ........................................... 15 2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin ......................................... 15 2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân ........................................................................................ 15 2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa............................................................................................ 16 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 17 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 17 Chương 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN.......................................... 18 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn ...................................................................... 18 3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol .................................................................................................. 19 3.2.1. Quy trình bào chế chung .......................................................................... 19 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa ......................................... 20 3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ........................................................... 20 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................................... 24 3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy trình bào chế ....................................................................................................... 27 3.2.3. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol ................................ 29 3.2.3.1. Quy trình bào chế ............................................................................... 29 3.2.3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra ................................... 30 3.3. Bàn luận .......................................................................................................... 32 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 CHL Cholesterol 2 HSPC Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa 3 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành 4 HEPES Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan sulfonic acid 5 PDI Chỉ số đa phân tán 6 DOX Doxorubicin 7 DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid 8 KTTP Kích thước tiểu phân 9 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 10 TKKH Tinh khiết hóa học 11 USP Dược điển Mỹ 12 DĐVN Dược điển Việt Nam 13 TMT-LS Liposome tác động vào khối u di căn 14 EE Hiệu suất liposome hóa 15 PEG Polyethylen glycol DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu được sử dụng. 14 Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng 233 và 481 nm (pH 4). 18 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP liposome. 21 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 23 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 25 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome hóa 25 Bảng 3.7 So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau 27 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và hiệu suất liposome hóa 28 Bảng 3.9 Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên các hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid. 2 Hình 1.2 Cấu trúc liposome. 4 Hình 1.3 Kích thước một số loại liposome. 6 Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng. 9 Hình 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin. 18 Hình 3.2 Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác nhau. 21 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi PDI (A) và KTTP (B) theo tỷ lệ dung môi. 21 Hình 3.4 Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích các mẫu trước (A) và sau (B) lọc tiếp tuyến. 24 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi. 23 Hình 3.6 Đồ thị biểu diến sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo nhiệt độ. 26 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế. 30 Hình 3.8 Ảnh chụp TEM liposome. 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu về liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy mô công nghiệp Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục đích: 1. Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol. 2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Doxorubicin 1.1.1. Đại cương về doxorubicin Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid - Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5, 12-napthacenedion [22]. - Tính chất: điều kiện thường tồn tại ở dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam không mùi, tan trong nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran. Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22]. - Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [10]. - Doxorubicin là chất nhạy cảm với ảnh sáng ở nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ điều trị doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng, không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ. Thực tế dung dịch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25oC, lâu hơn khi bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4oC [22]. - Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân [2]. - Dược động học: sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol. - Công thức phân tử: C27H29NO11. HCl. - Khối lượng phân tử: 579,99. 3 Khoảng 40 – 50% bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không qua hàng rào máu não nhưng qua nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa [2], [5], [22]. Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do. Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Các liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường. Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [5], [22]. - Chỉ định chính: ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [2]. Chỉ định tương đối: ung thư tuyến tiền liệt, cổ tử cung, âm đạo, dạ dày. Có tác dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như đa uy tủy xương, u màng hoạt dịch, u nguyên bào võng mạc [2], [22]. - Chống chỉ định: có biểu hiện suy giảm chức năng tủy xương rõ, suy tim, quá mẫn với các thành phần của thuốc [2], [22]. - Tác dụng không mong muốn: độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng và tần số dùng thuốc. Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng tóc, buồn nôn, đặc biệt là chèn ép tủy và độc tính trên tim. Ngoài ra còn gặp một số tác dụng phụ khác như: suy giảm chức năng tủy xương, viêm miệng, rối loạn tiêu hóa, nóng rát bàng quang và niệu đạo [2], [22]. 1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường - Chế phẩm dạng quy ước: + Dung dịch tiêm: Adorucin, Adriamicin, Adrim, Doxorubicin DBL, Doxorubicin Ebewe + Bột pha tiêm: Adriblastina, Doxorubicin, Doxorubicin sevycal, Doxtie, Zodox 4 - Chế phẩm dạng liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet 1.2. Đại cương về liposome 1.2.1. Khái niệm Liposome là một dạng đặc biệt của vi nang, bao gồm một vỏ phospholipid kép có đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [4]. Hình 1.2. Cấu trúc liposome [8]. 1.2.2. Ưu nhược điểm của liposome 1.2.2.1. Ưu điểm - Phospholipid là tá dược phân giải sinh học cao, không độc với cơ thể, không gây đáp ứng miễn dịch khi đưa vào tuần hoàn do vậy liposome được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao nhất [23]. - Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân nước và dược chất thân dầu. Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [18]. - Cấu tạo và tính chất hóa lý tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của dược chất, mang các dược chất chữa bệnh nội bào [3], [4]. 5 - Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome do đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [23]. - Làm thay đổi phân bố sinh học của một số dược chất có độc tính cao, dùng liều thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn do đó làm giảm phân bố thuốc tại cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với dược chất tự do, làm giảm độc tính và tác dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm dược chất [3], [4], [23]. - Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa làm tăng độ tan của dược chất hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [3], [4]. 1.2.2.2. Nhược điểm Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng liposome hiện nay vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do một số nhược điểm sau: - Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của liposome ngắn. Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài [4]. - Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong quá trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự thống nhất giữa các lô mẻ nên khó triển khai sản xuất lớn [4]. - Tỷ lệ liposome hóa của dược chất thấp, khó mang dược chất có phân tử lượng lớn [4]. - Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [21]. - Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [26]. - Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn [21]. 6 - Hiện chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome. Ví dụ như hội chứng tay chân (Hand and foot syndrome) không xuất hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21]. 1.2.3. Phân loại 1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp [11] Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong liposome – MVV), Liposome đơn lớp lớn (LUV), Liposome đơn lớp nhỏ (SUV), Liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), Liposome đa lớp nhỏ (OLV) Hình 1.3. Kích thước một số loại liposome [5] 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ - Liposome quy ước: cấu tạo gồm có vỏ lipid và nhân nước. Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường [1], [5], [7]. - Liposome hiện đại: Cấu trúc được thay đổi để khắc phục nhược điểm của liposome quy ước nhằm tạo ra một hệ mang thuốc hiệu quả gồm: + Liposome gắn các yếu tố ổn định (long circualating liposomes): độ ổn định cao, thời gian tồn tại trong tuần hoàn từ vài ngày đến hàng tuần [4], [5], [7], [20]. + Liposome miễn dịch (immune liposomes): bề mặt gắn kháng thể, có khả năng liên kết với receptor đặc trưng tại cơ quan đích, có thể giải phóng dược chất tại ngoại bào gần tế bào đích [4], [5], [7], [20]. + Liposome miễn dịch tồn tại lâu trong tuần hoàn (long circulating immune liposomes): liposome kết hợp ưu điểm của liposome tồn tại lâu trong tuần hoàn và 7 liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome [1], [4]. + Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome) [1], [4]. + Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) [1], [4]. + Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [4]. + Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể [4], [13]. + Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng t