Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenens

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Nguyễn Ngọc Hải Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng  TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Phòng phân tích hóa lý – Trung tâm phân tích thí nghiệm, Trƣờng đại học Nông Lâm  Những anh chị lớp Thú y K26; các bạn lớp Chăn nuôi K27 đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cùng thời gian với tôi tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập  Ba mẹ đã luôn động viên, chăm lo cho con trong suốt thời gian thực hiện đề tài 4 TÓM TẮT TRẦN HẠNH TRIẾT, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các chủng vi khuẩn L. sporogenes phân lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA). Bƣớc đầu, chúng tôi tìm hiểu về đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa của vi khuẩn. Sau đó, tiếp tục khảo sát những đặc tính khác: khả năng sinh acid lactic trong môi trƣờng 10% sữa đặc có đƣờng; khả năng hình thành bào tử trong hai loại môi trƣờng nuôi cấy MRSA và GYE, hai điều kiện nhiệt độ - thời gian 370C/6 ngày và 370C/2 ngày chuyển sang 500C/2 giờ và 700C/2 giờ. Những khảo sát về mặt sinh trƣởng và phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L. sporogenes sau này. Những kết quả đạt đƣợc: 1. Đã phân lập đƣợc vi khuẩn L. sporogenes 2. Vi khuẩn L. sporogenes có khả năng sản sinh acid lactic nhƣng hàm lƣợng không cao (0,144 – 0,342 g/100 ml môi trƣờng sữa) 3. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử (370C/6 ngày và 370C/2 ngày → 500C/2 giờ → 700C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát 5 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................... viii Danh sách các bảng ............................................................................................................... ix Danh sách các hình................................................................................................................ ix Danh sách các sơ đồ ............................................................................................................... x 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2. Mục đích .................................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu ...................................................................................................................... 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................................. 2 2.1. Tổng quan về probiotic ............................................................................................. 2 2.1.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................... 2 2.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic ............................................................. 2 2.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme ................................... 2 2.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B ......................................................... 2 2.1.2.3. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột .............................................. 3 2.1.2.4. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất .................................. 3 2.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch ............................................................ 4 2.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi ........................ 4 2.1.3.1. Trong nƣớc .......................................................................................... 4 2.1.3.2. Thế giới ............................................................................................... 5 2.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes ................................................................... 5 2.2.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................ 5 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại ........................................................................................ 5 2.2.3. Đặc điểm phân bố .......................................................................................... 6 2.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................. 6 2.2.4.1. Tế bào sinh dƣỡng ............................................................................. 6 2.2.4.2. Bào tử ................................................................................................ 8 2.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác .......................................................................................... 9 2.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất .......................................................... 10 2.2.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu ................................................. 13 2.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic ................................................................................... 15 2.2.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes ........................................ 18 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM............................................................ 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ............................................... 19 3.1.1. Thời gian ....................................................................................................... 19 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................................ 19 3.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 19 3.2.1. Mẫu khảo sát ................................................................................................. 19 3.2.2 Môi trƣờng ..................................................................................................... 19 3.2.3. Hóa chất......................................................................................................... 19 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ ......................................................................................... 19 3.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 19 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................. 20 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài ............................................................ 20 3.4.2. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 20 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào .................................................. 21 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa ........................................................... 22 3.4.3.Khả năng sinh acid lactic ................................................................................ 22 3.4.3.1. Định tính ............................................................................................ 22 3.4.3.2. Định lƣợng ......................................................................................... 23 7 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử .................................................................................. 24 3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 27 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................................... 28 4.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes ........................................................... 28 4.1.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 28 4.1.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes ..................................................... 28 4.1.2.1. Quan sát khuẩn lạc ......................................................................... 28 4.1.2.2. Quan sát hình thái tế bào ................................................................ 29 4.1.2.3. Quan sát hình thái bào tử................................................................ 29 4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes ...................................................... 29 4.2. Khả năng sinh acid lactic ......................................................................................... 31 4.2.1. Định tính ....................................................................................................... 31 4.2.2. Định lƣợng ................................................................................................. 32 4.3. Khảo sát khả năng hình thành bào tử ......................................................................... 34 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................... 36 5.1. Kết luận..................................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 36 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 37 PHỤ LỤC 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức khỏe MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar GYE Glucose Yeast Extract SD standard deviation, độ lệch chuẩn 9 DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus ........ 6 Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus ...................... 6 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus ..................................................................................................................... 7 Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus .............................................................................................................................. 8 Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus .......................................... 11 Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus ...................... 12 Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus ............. 17 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L. sporogenes . 24 Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes .......................................................... 28 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm . 30 Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa .......... 31 Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất ............. 33 Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát ......... 34 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử ........................................................................................ 8 Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic ............................................................................ 11 Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol ................................................ 14 Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE ................................. 38 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi .... 29 Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes ................... 31 Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes .................................... 32 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 10 SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu ................................... 13 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes ........... 20 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes .............................................. 20 Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa ............................ 21 Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa ......................................................... 22 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner ................................................................ 23 Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes....... 25 11 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi. Hiện nay, bệnh đƣờng tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những tác dụng phụ. Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học) ngày càng đƣợc chú trọng. Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các enzyme của chúng. Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại hệ vi sinh vật đƣờng ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trƣởng của thú nuôi. Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng. Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dƣỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt tính ổn định. Nhờ vậy mà L. sporogenes ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất chế phẩm sinh học. 1.2. Mục đích Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic). 1.3. Yêu cầu Phân lập các chủng L. sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn. Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy thay đổi. 12 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3. Tổng quan về probiotic 2.3.1. Định nghĩa về probiotic Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô tả những yếu tố kích thích sinh trƣởng do vi sinh vật tạo ra [4]. Những nghiên cứu tiếp theo giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic. Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ probiotic đƣợc hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hƣởng có lợi đối với động vật và ngƣời bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đƣờng ruột vật chủ [4]. Những vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2]. 2.3.2. Các chức năng sinh học của probiotic 2.3.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme Vi sinh vật đƣờng ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong khẩu phần nhƣ: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng nhƣ: amylase, protease, cellulase… Nhóm này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas, Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,… Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu và Mn cho gà đẻ [2]. Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hƣởng phần nào lên sức đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất. 2.3.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B6, B12 và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. 13 Bản thân tế bào nấm men có chứa một lƣợng dinh dƣỡng rất cao bao gồm: protein, lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trƣởng và sức đề kháng. 2.3.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm [27]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc đƣợc sinh ra trong quá trình tiêu hóa nhƣ: indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trƣờng. 2.3.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đƣờng tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Việc bổ sung probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật đƣờng ruột thôn