Khóa luận Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh tswv (tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật rt - Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................................... ii Cảm tạ ............................................................................................................................ iii Tóm tắt ............................................................................................................................ iv Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ........................................................................................................ xi Danh sách các đồ thị ....................................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................................ xii Danh sách các sơ đồ ...................................................................................................... xii Phần I. Mở Đầu .............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu .................................................................................................. 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 1 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................................ 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu ....................................................................................... 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt ................................................................................................... 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt ........................................................................ 2 2.1.3.1 Thân ............................................................................................................... 2 2.1.3.2 Rễ ................................................................................................................... 2 2.1.3.3 Lá ................................................................................................................... 2 2.1.3.4 Hoa ................................................................................................................. 3 2.1.3.5 Quả ................................................................................................................. 3 2.1.3.6 Hạt .................................................................................................................. 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt .................................................................................. 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt ..................................................................................... 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác .................................................... 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt .................................................................. 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ................................................................................................................ 9 2.3.2 Ánh sáng .............................................................................................................. 9 2.3.3 Ẩm độ .................................................................................................................. 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng ............................................................................................... 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) ............................................... 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV ................................................................................. 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV ................................................................................................. 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh .............................................................................. 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV ................................... 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt ................................................................................. 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học ......................................................................... 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển ................................................................................. 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV ......................................................................................... 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV ......................................................................................... 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị .................................................................................. 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận .................................................................................... 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống ................................................................................... 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.......................................... 19 2.12 ELISA .................................................................................................................... 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA ....................................................................................... 19 2.12.2 Phân loại ELISA .............................................................................................. 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ................................................................ 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp ......................................................................................... 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA ....................................................................................... 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh ...................................................................... 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA ............................... 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA ...................................................... 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................... 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR .......................................................................... 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .................................................. 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR .................................................................. 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết ................. 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn .................. 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn ................... 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào........................................................ 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu ...................................................................................... 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau ....................................................... 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................................... 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR ......................................................................................... 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc .................................................................. 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .................................................................... 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................ 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV .... 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................................... 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu .................................................... 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu ............................................................................ 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV ....................................................................... 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA ....................................................................... 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA ................. 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện ...................................................................................... 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR ................................................................... 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad ................................... 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di .............................................. 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR .......................................................... 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR ......................................................................... 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di ............................................................ 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận ....................................................................................... 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA ... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra ................................................. 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng ........................................................ 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi ............................................................... 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR ................................................................................... 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA ....................................................................................... 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer ..................................................................................... 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR.............................................................................. 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR ........................................... 54 Phần V. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 60 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 60 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC ................................................................................................. 64 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh ............................................................ 4 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV ............................................... 13 Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt ......................................................................... 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng .... 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ............................................................. 49 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.45 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng ......................................................................... 49 Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt ................................................................... 50 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV .................................................................................... 11 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV ................................................... 12 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV ......................................................... 14 Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV ........................................................................................ 15 Hình 2.5: Các loài bọ trĩ ................................................................................................ 16 Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................ 24 Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc ..................................................... 33 Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc ...................................... 34 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA ........................................................................ 39 Hình 4.1: Ớt Ba tri bị nhiễm TSWV.............................................................................. 46 Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV ................................................................. 46 Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong .................................................. 47 Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn ............. 47 Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ .......................................... 48 Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ .................................... 48 Hình 4.7: Kết quả điện di RNA ..................................................................................... 51 Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng ..................................................................... 53 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ........................................... 20 Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ........................................... 21 Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp .......................................... 21 Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp .......................... 22 Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA ........................................................................................... 34 1 Phần I Mở Đầu 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây vừa nhƣ một loại rau, vừa nhƣ một loại gia vị. Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin nhƣ: A, B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác. Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nƣớc ta cây ớt đƣợc trồng với diện tích và sản lƣợng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu