Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải ssr 60f và coker 312 bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Cúc Hoà Sinh viên thực hiện: Phạm Quyết Thắng 3 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Các Thầy cô trong và ngoài Trƣờng Đại Học Nông Lâm. Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại trƣờng. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS. Trần Thị Cúc Hòa- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận. TS. Trần Ngọc Thạch đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Phạm Quyết Thắng 4 TÓM TẮT PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ CÚC HÒA Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đƣa vào những đặc tính mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… là điều rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nƣớc ta hiện nay. Việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam. Việc sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose có ƣu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh học nhƣ đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh. Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực hiện nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp. Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã đƣợc thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và đƣợc chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi đƣợc chuyển nạp, mẫu cây đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc. Kết quả đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai vòng thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải. Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 5 ABSRACT PHAM QUYET THANG, Nong Lam University. August 2005. “STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ” Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the cotton industry of our country at present. The application of mannose selection and Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam. The application of mannose selection system has an advantage because it does not cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics. The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen calli of cotton after transformed. In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus. The hypocotyl segments of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using Agrobacterium tumefaciens. After transformed the explants were cultured on the medium containing mannose passing three cycles of selection. The results were recorded as follows. During the 1 st and 2 nd cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars grew normally. At the 3 rd cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously. It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the cultivar SSR60F. The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the 3 rd cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to make the selection of putative transformed calli more precise. Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each cycle of selection, the size of calli, etc. to improve the efficiency of mannose selection for cotton. Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam. 6 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .......................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................... viii Danh sách các hình ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .............................................................................................x 1. LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1 1.2. Mục tiêu .....................................................................................................3 1.3. Hạn chế của khoá luận ...............................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4 2.1. Cây bông vải ..............................................................................................4 2.1.1. Vị trí và phân loại ..............................................................................4 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố ................................................4 2.1.2.1. Gossypium hirsutum ....................................................................4 2.1.2.2. Gossypium arboreum ..................................................................5 2.1.2.3. Gosypium barbadense .................................................................5 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ...............................................6 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ...............................................7 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải .......................................10 2.2.1. Hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống..........................10 2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải ....................10 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..................12 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............................13 2.3.2. Plamid Ti .........................................................................................14 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA ..............................................................15 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir .............................................................17 2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm .......................................................................19 7 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................................................22 3.1. Vật liệu ..................................................................................................22 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................22 3.3. Phƣơng Pháp .........................................................................................22 3.3.1. Quy trình chuyển nạp gen ...............................................................22 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ........................................................22 3.3.1.2. Nguồn Plasmid ..........................................................................23 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn ......................................................................24 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy ...........................................................................24 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh cây ...........................................................25 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................26 3.3.2.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ............................................................26 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc .......................................................................26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28 4.1. Sự hình thành mô sẹo ............................................................................28 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo ..............................................................28 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ..................................................................31 4.2 Kết quả thanh lọc ..................................................................................34 4.2.1. Thanh lọc lần 1 ................................................................................34 4.2.2. Thanh lọc lần 2 ................................................................................36 4.2.3. Thanh lọc lần 3 ................................................................................38 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43 5.1. Kết luận .................................................................................................43 5.2. Đề nghị ..................................................................................................43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................44 PHỤ LỤC 8 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine 5’- monophosphate ATP Adenosine 5’- triphosphate AS Acetosyringone CaMV35S Vùng khởi động phiên mã ctv. cộng tác viên DNA Deoxyribonucleotic acid gus gen gus (gen chỉ thị) GUS enzyme β-glucuronidase lacZ gen β-galactosidase LB Bờ trái (Left border) MLN mẫu lây nhiễm MS Murashige and Skoog (1962) MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng thanh lọc lần 1, 2, 3 OD600 Độ hấp thụ tối đa ở bƣớc sóng 600 nm ori Vùng khởi động sự tự tái bản PEG polyethylene glycol PMI Enzyme Phosphomannose isomerase pmi gen pmi plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi) RB Bờ phải (Right border) rpm vòng/phút (round per minute) T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA) YEP Yeast extract pepton Vir gen vir Vir virulence protein 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid v/v thể tích/thể tích (volume/volume) w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume) 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra .........13 Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra ..............14 Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA............................................19 Hình 2.4. Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây ......................20 Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây .......21 Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm ..................................................23 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi .................................................24 Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp trên môi trƣờng đồng MSCo ...........................28 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng MSRe ............29 Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng MSS1 ......................29 Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS2 .............30 Hình 4.5. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS3 .............31 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng MSRe ..........................................................33 Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1 ..........36 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc ..........38 Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng MSS3 ..............................39 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng MSS3 ........40 Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trƣờng MSS3 ...........41 10 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ..................................7 Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới .........................8 Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới ................................9 Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc ..........................25 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải ........................27 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 ................................32 Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F .....................................32 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 .........................................35 Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F .............................................35 Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 .........................................36 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F ..............37 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 .........................................41 Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F .............................................41 11 CHƢƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bông vải là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thỏa mãn nhu cầu bức thiết của con ngƣời sau ăn là mặc (Lê Quang Quyến, 2004). Cây bông cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai sau cây đậu tƣơng, hơn nữa hạt bông còn là nguồn cung cấp protein làm thức ăn cho gia súc (Jiang, 2004). Cây bông vải đƣợc trồng ở khắp nơi trên thế giới, nhƣng chủ yếu trồng ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong các nƣớc trồng bông vải, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất (9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ 24%, Trung Quốc 20% (Satyavathi và ctv., 2002). Ở Việt Nam, nghề trồng bông vải có từ lâu đời. Cây bông vải từng là cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ đặc biệt ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp (Lê Kim Hỷ, 2003). Sau ngày thống nhất đất nƣớc, chúng ta đã nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông lại ở các địa phƣơng trên nhƣng các kế hoạch đó đều không thành công. Hai nguyên nhân chính làm thất bại các nỗ lực trên là: thị trƣờng giá cả bấp bênh, nông dân không trồng bông vì không trừ đƣợc sâu đục quả bông dẫn đến ngƣời trồng bông thua lỗ (Lê Quang Quyến, 2004). Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật và công nghệ nên đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu năng suất cao đƣa vào sản xuất. Tuy nhiên, sản lƣợng bông xơ chỉ mới đáp ứng một phần nhỏ (10-15%) nhu cầu vật liệu cho ngành dệt may. Trƣớc thực trạng đó, gia tăng sản lƣợng bông xơ là yêu cầu cấp thiết. Dự kiến đến năm 2010, sản lƣợng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nƣớc và diện tích bông đạt 1 triệu ha vào năm 2010, tập trung chủ yếu ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng Bằng Sông Cửu Long (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003). Việc cải thiện di truyền của các loài bông vải nhằm tăng năng suất cũng nhƣ tăng tính kháng sâu bệnh đã đƣợc quan tâm nhiều. Kết quả là nhiều giống bông vải tốt đƣợc tạo ra theo các phƣơng pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống. Tuy nhiên, việc sử dụng các phƣơng pháp này khó có thể khai thác đƣợc các nguồn gen có lợi một cách 12 có hiệu quả do rào cản bất tƣơng hợp. Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen trên thực vật nói riêng có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống bông có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ: kháng sâu bệnh hại, kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng (rét, khô, hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng của bông và sợi (Perlak và ctv., 2001). Tuy nhiên, việc chuyển nạp gen vào cây bông vải đã gặp phải nhiều khó khăn. Cây bông vải đƣợc xem là cây rất khó chuyển nạp gen với hiệu quả cao. Hơn nữa, ở Việt Nam các phƣơng pháp nuôi cấy mô hiện tại dùng để tái sinh cây chuyển gen từ các mô sẹo hoặc từ tế bào có khả năng sinh phôi chƣa đƣợc xây dựng hoàn chỉnh. Ngoài giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có khả năng sinh phôi sẽ có hình dạng dị thƣờng do biến dị soma phát triển trong quá trình nuôi cấy mô. Hiện nay, việc chuyển nạp gen mới chỉ thành công trên các giống nhóm Coker, hầu hết các gen mong muốn đều đƣợc chuyển vào các giống Coker và sau đó đem hồi giao với các giống khác (Nobre và ctv., 2001). Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chƣa thành công nhiều, việc chuyển nạp gen chỉ đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các phƣơng pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhƣng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây chuyển gen giả định là không đƣợc hoàn toàn, tạo ra các cây thể khảm, gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận