Khóa luận Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật elisa, RT- PCR và giải trình tự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này. TS. Bùi Minh Trí, ThS. Trần Nhật Phƣơng cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trƣờng đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà đã hết lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Vƣơng Hồ Vũ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT- PCR và giải trình tự” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến Đề tài thực hiện các nội dung sau: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. 2. Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của đoạn gen này. Kết quả đạt đƣợc 1. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng nhƣ sau: - Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% 2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tƣơng đồng 100% sau khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... vii Danh sách các bảng ............................................................................................. viii Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. ix 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây ....................................................... 3 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây ..................... 4 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) ...................................................... 4 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) ...................................................... 5 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) ........................................... 6 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây ............................................................... 8 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài ............................................................ 8 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 8 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ ............................................................................. 8 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây ................................................. 8 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép .................................................................... 9 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử .................................... 9 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ............. 9 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich ............................... 10 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) ............................ 10 vi 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR ............................................................................. 10 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen .................................................................. 11 2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây ....... 12 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV ............................ 12 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV ............................... 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 14 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 14 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV .. 14 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV ................... 15 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA ................................................. 15 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR ........................................ 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16 3.3.1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 16 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu .......................................................... 16 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV ....................................... 17 3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA ......... 17 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR .................... 20 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV .......................... 25 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 27 4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt ...................................... 27 4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA ............ 27 4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phƣờng ............................................... 27 4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống ............................................................ 29 4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ ........................................................... 30 4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi ............................................................. 30 4.3 Kết quả RT-PCR ............................................................................................ 31 4.4 Kết quả giải trình tự ....................................................................................... 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 37 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 40 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid - ctv: Cộng tác viên -ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20 - PLRV: Potato leafroll virus - p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction - PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y - VPg: Protein linked genome viii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc TP.Đà Lạt ....................................... 17 Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể ....................................................................... 18 Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme ................................................... 19 Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu .............................................................. 20 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ....................... 23 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ................. 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng ...................................... 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV ........................................ 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống ......................................... 29 .... Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ ................................ 30 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi ......................... 30 .... Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ........... 31 Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ..... 32 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Hình thái của virus PVX ............................................................................... 5 Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX...................................................................... 5 Hình 2.3 Hình thái virus PVY ................................................................................................ 6 Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY...................................................................... 6 Hình 2.5 Hình thái virus PLRV .............................................................................................. 7 Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá ............................................................................ 7 Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR .................................................................. 11 Hình 4.1 Kết quả điện di ............................................................................................ 33 Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer ............................................... 34 Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer ........................................ 34 Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer ............................................................... 35 Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV ..... 36 Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen .... 36 Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng ................ 28 Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 ................................ 29 Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ ............................................. 29 Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi .................................................... 31 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng nhất của con ngƣời (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ). Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982). Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với các loại giống chủ yếu nhƣ 06 và 07. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây ra là hết sức cần thiết. Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện đƣợc. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng nhƣ phòng trừ bệnh virus trên khoai tây. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” 2 1.2 Mục đích - Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. - Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này. 1.3 Yêu cầu - Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phƣờng trên địa bàn thành phố Đà Lạt. - Thực hiện phản ứng RT-PCR với mẫu có kết quả dƣơng tính với virus PLRV. - Lấy sản phẩm RT-PCR của virus PLRV đi giải trình tự và so sánh với ngân hàng gen. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây Khoai tây vừa là lƣơng thực vừa là thực phẩm có giá trị. Ở nhiều nƣớc Âu, Mỹ, khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một lƣơng thực chính sau lúa mì: 23 - 30% sản lƣợng khoai tây đƣợc dùng để ăn; còn ở những nƣớc khác nhƣ châu Á thì khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thực phẩm hoặc là lƣơng thực phụ. Khoai tây có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nƣớc Chi Lê, Pêru, Braxin, Bôlivia, trên các miền núi có khí hậu mát và ẩm. Hiện nay, ở những nƣớc này vẫn còn tìm thấy những loài khoai tây hoang dại. Tuy nhiên khoai tây đƣợc trồng đầu tiên ở các nƣớc thuộc Châu Âu. Năm 1561, khoai tây đƣợc trồng sớm nhất tại Tây Ban Nha, giống lấy từ Pêru. Ở Việt Nam, khoai tây đƣợc trồng khoảng 100 năm nay (cùng với bắp cải, cà chua, cải bông). Những nơi trồng khoai tây sớm nhất là Thƣờng Tín (Hà Đông), Từ Sơn (Hà Bắc), Tú Sơn (Hải Phòng), ngoại thành Hà Nội với sản lƣợng chiếm 85% sản lƣợng khoai tây của Việt Nam. Ở Đà Lạt khoai tây đƣợc trồng quanh năm và chiếm 15% sản lƣợng. Vấn đề quan trọng cần lƣu ý trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại, đặc biệt là những bệnh do virus gây ra. Khoai tây có thể bị đơn nhiễm hoặc tạp nhiễm khoảng 30 loại virus, chủ yếu là Luteoviruses (PLRV), Potyviruses (PVY, PVA, PVV), Potexviruses (PVX) và Carlaviruses (PVM, PVS). Khoảng 50% số virus này sống kí sinh bắt buộc trên khoai tây, số còn lại thì có thể sống trên các loại cây khác. Các virus này có tính thích nghi cao và lây nhiễm dễ dàng thông qua củ bị nhiễm cũng nhƣ các yếu tố lan truyền khác. Virus và bệnh virus là một trong những nguyên nhân ức chế sự phát triển của khoai tây dẫn đến sự giảm sút về năng suất và chất lƣợng. Những bệnh do virus thƣờng khó phát hiện hơn các bệnh do vi khuẩn và nấm. Khi cây bị bệnh sẽ có các triệu chứng khác nhau nhƣ dạng khảm, đốm, xoắn lá, lá nhăn nheo và hoại tử. Bệnh thƣờng gây thiệt hại nặng khi bị nhiễm nhiều loại virus cùng lúc (ví dụ năng suất có thể giảm 80% khi nhiễm cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 1982) và chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng canh tác. Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS. 4 Khi nhiễm nhiều virus thì bên cạnh việc các virus tác động tổng hợp còn ảnh hƣởng đến khả năng đề kháng với mầm bệnh khác. Ví dụ: Khi đã bị nhiễm PVX và PVY trƣớc đó thì tính kháng với PLRV giảm (Jayasinghe và ctv, 1989), tăng tính mẫn cảm với bệnh thối (Karla và ctv, 1989). Các kết quả nghiên cứu cho thấy có khoảng trên 20 loài rệp và côn trùng có thể là vectơ truyền bệnh virus trên khoai tây, trong đó chủ yếu là loại rệp Myzus persicae (Watson, 1956). 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) - Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không có vỏ bọc, có cấu trúc xoắn đối xứng, sợi virus ngoằn ngoèo, dài 515 nm, đƣờng kính 13 nm (Brandes, 1964). Virus này có acid nucleic là một phân tử RNA (+ssRNA: +single strand RNA) trọng lƣợng phân tử là 2,1*106, chiếm 6% trọng lƣợng virus (Huisman và ctv, 1988), chứa khoảng 6435 base, có đuôi 3’ là poly A (Huisman và ctv, 1988), phần trăm về số mole tƣơng ứng giữa các nucleotide G, A, C và U là 22%, 32%, 24% và 22% (Knight, 1963). - PVX có vỏ protein có trọng lƣợng 30.000 dalton, chiếm gần 94% trọng lƣợng virus (Shaw và Larson, 1962). Trọng lƣợng phân tử của virus là 35*106 Da (Reichmann, 1959), thể tích của hạt virus là 0,73 cm3/g, hệ số lắng 117,7 S, điểm đẳng điện PI = 4,4, thời gian sống: 40 - 60 ngày, nhiệt độ bất hoạt trong khoảng 68 - 76oC tùy từng dòng virus. PVX duy trì hoạt lực ở 20oC trong vài tuần và trong glycerol hơn một năm, bị tiêu diệt khi xử lý bằng protease, phenol hay thuốc tẩy, hiệu giá virus: 10-5 - 10 -6 . - Với những đặc điểm trên, virus PVX có ký chủ giới hạn trong những cây thuộc họ cà (Solanaceae) và một số loại cây có quan hệ thân thuộc nhƣ Amaranthaceae và Chenopodiaceae. - Khi bị nhiễm virus PVX thì thƣờng biểu hiện triệu chứng nhẹ, ngầm, không thấy biểu hiện trên lá hoặc không tác động rõ ràng trên cây khỏe, tạo ra những đƣờng vằn hoặc là vết hoại tử n