Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisoppliae dựa vào trình tự gen pr1 và ứng dụng rdna - Its

Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất nông nghiệp ngƣời nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị trƣờng xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên việc sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lƣợng ngày càng tăng đã và đang ảnh hƣởng nặng nề đến môi trƣờng, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lƣợng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Trƣớc thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng. Một trong những phƣơng pháp đó là kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc để phòng trừ và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại một cách hiệu quả và an toàn hơn.

pdf76 trang | Chia sẻ: lvbuiluyen | Lượt xem: 2120 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisoppliae dựa vào trình tự gen pr1 và ứng dụng rdna - Its, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SỰ ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: TRẦN NHÂṬ NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SƢ ̣ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: ThS. VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHÂṬ NAM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn:  Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.  Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  TS. Lê Đình Đôn, ThS. Võ Thị Thu Oanh , CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.  Anh Nguyêñ Văn Lâm̃ đã hết lòng hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, chia sẻ kinh nghiêṃ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Xin cám ơn cuôc̣ sống đa ̃đem laị cho tôi nhƣ̃ng ngƣời baṇ , nhƣ̃ng ngƣời đa ̃cùng tôi chia sẻ và động viên tôi trong suốt quá trình thƣc̣ hiêṇ khóa luâṇ. Xin chân thành cảm ơn! TRẦN NHÂṬ NAM iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sƣ ̣tính đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS “ đƣợc thực hiện từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhâṭ Nam thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS . Võ Thị Thu Oanh và TS. Lê Đình Đôn. Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây hại. Đây là giống nấm có hoaṭ tính tiêu diêṭ côn trùng maṇh . Mục đích đề tài nhằm nghiên cƣ́u sƣ ̣đa daṇg về măṭ di truyền giƣ̃a các dòng nấm dƣạ trên cơ sở trình tƣ ̣ nucleotide của gen Pr1 và vùng rDNA-ITS Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Xác định đƣợc những dòng nấm Metarhizium anisopliae sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u thuôc̣ dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae. - Phát hiện gen Pr1 ở trên 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae. Tiến hành giải trình tự gen Pr1 của10 mâũ nấm. Kích thƣớc của gen Pr1 ở 7 mâũ nấm là 1091bp. - Có sự khác biêṭ về măṭ di truyền giƣ̃a các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và giƣ̃a các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank .Tỉ lệ tƣơng đồng giữa các dòng trong nƣớc khoảng 95-100%, và giữa các dòng trong nƣớc so với các dòn g trên thế giới là 94-99% khi so sánh trình tƣ ̣gen Pr1 - Phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 so với nhƣ̃ng dòng còn lại. Nhƣ̃ng đôṭ biến này đều xảy ra ở vùng ITS1. - Có sự bảo tồn cao trong vùng 5.8S và vùng ITS2 giƣ̃a nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong đề tài . Tỉ lệ tƣơng đồng giữa những dòng trong nƣớc là 99- 100% và giữa các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank là 92-100% khi so sánh trình tƣ ̣ vùng rDNA-ITS. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................viii Danh sách các bảng ............................................................................................... ix Danh sách các hình ................................................................................................ x 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài .................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu đề tài .............................................................................................. 2 1.3.Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1. Giới thiêụ nấm Metarhizium anisopliae ............................................................... 3 2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. ................. 6 2.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................................. 7 2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm .................................................... 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. ............... 8 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................... 8 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................... 9 2.6. Giới thiêụ gen Pr1 .............................................................................................. 10 2.7. Vai trò của Protease Pr1 ..................................................................................... 10 vi 2.8.Tổng quan về ITS-rDNA ..................................................................................... 10 2.8.1. Giới thiêụ về vùng rDNA và vùng ITS ...................................................... 10 2.9. Môṭ số nghiên cƣ́u trong nƣớc và nƣớc ngoài về sƣ ̣đa daṇg của nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ................................. 12 2.9.1. Nghiên cƣ́u nƣớc ngoài ............................................................................. 12 2.9.2. Nghiên cƣ́u trong nƣớc .............................................................................. 14 2.10. Phƣơng pháp phát hiêṇ gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ....................................... 14 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 16 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 16 3.1.1. Thời gian ................................................................................................... 16 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................... 16 3.2. Vật liệu và hoá chất ............................................................................................. 16 3.2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 16 3.2.2. Hoá chất .................................................................................................... 17 3.2.3. Các thiết bị chính ...................................................................................... 17 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 18 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18 3.4.1.Kiểm tra DNA tổng số đƣơc̣ ly trích tƣ̀ các dòng nấm Metarhizium anisopliae ............................................................................................................. 18 3.4.2. Khuếch đại gen Pr1 ................................................................................. 18 3.4.3. Khuếch đaị vùng rDNA-ITS ..................................................................... 21 3.5. Tiến hành giải trình tƣ ̣gen gây đôc̣ Pr1 và vùng ITS .................................... 22 3.6. Tinh sac̣h sản phẩm PCR ................................................................................ 22 3.7. Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự..................................................................... 24 3.8. Phƣơng pháp phân tích trình tƣ ̣...................................................................... 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 26 4.4. DNA của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ dùng trong nghiên vii cƣ́u ............................................................................................................................. 26 4.5. Kết quả tinh sac̣h DNA tổng số ...................................................................... 28 4.6. Kết quả khuếch đaị vùng ITS1-5.8S-ITS2. .................................................... 28 4.7. Kết quả giải trình tƣ ̣vùng ITS1-5.8S-ITS2 .................................................... 29 4.8. Kết quả khuếch đại gen Pr1………………………………………………...36 4.9. Kết quả đoc̣ trình tƣ ̣gen Pr1………………………………………………………36 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 42 5.4. Kết luận .......................................................................................................... 42 5.4.2. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 ............................................................. 42 5.4.3. Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS ................................................ 42 5.5. Đề nghị ........................................................................................................... 43 5.6. Hạn chế của đề tài ........................................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................... 47 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BXĐTG : Bọ xít đen Tiền Giang BXĐTV : Bọ xít đen Trà Vinh RBCQ9 : Rầy bông cúc Quận 9 BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTV5 : Bọ dừa Trà Vinh 5 BDTN : Bọ dừa Tây Ninh BDBD7 : Bọ dừa Bình Định 7 SCLLLA : Sâu cuốn lá lúa Long An RNBT : Rầy nâu Bến Tre RNLA : Rầy nâu Long An ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction Rpm : Revolutions per minute ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giới thiêụ nấm Metarhizium anisopliae ............................................... 3 Bảng 3.1 Nguồn nấm Metarhizium anisopiae đƣơc̣ thu thâp̣ ở môṭ số điạ phƣơng dùng trong thí nghiêṃ ........................................................................................ 16 Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR1/METPR4 ......................................................................................................... 19 Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR2/METPR5 ......................................................................................................... 20 Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA -ITS .... .21 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng đọc trình tự ................................................ 23 Bảng 4.1 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơc̣ dùng để so sánh trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS. .................................................................................... 30 Bảng 4.2 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS ..................................................................... 31 Bảng 4.3 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS.................................................33 Bảng 4.4 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơc̣ dùng để so sánh trình tự gen Pr1 ....................................................................................................... 37 Bảng 4.5 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1 .................................................................................. 38 Bảng 4.6 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1..............................................................40 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau ........................................................................................................ 5 Hình 2.2 Sơ đồ của các vùng trên rDNA ............................................................. 12 Hình 3.1 Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg để khuếch đaị gen Pr1 .............................. 18 Hình 3.2 Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg để khuếch đaị vùng ITS ........................... 21 Hình 3.3 Nhƣ̃ng phƣơng pháp đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong phân tích trình tự ................ 24 Hình 3.4 Sơ đồ phân tích trình tƣ ̣có đô ̣tƣơng đồng cao ..................................... 25 Hình 4.1 DNA tổng số của nấm Metarrhizium anisopliae ...................................... 26 Hình 4.2 Sơ đồ tinh sac̣h DNA tổng số của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u ......................................... 27 Hình 4.3 DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ tinh sac̣h ........... 28 Hình 4.4 Hình khuếch đại vùng rDNA-ITS ........................................................ 28 Hình 4.5 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS ........................................................ 32 Hình 4.6 So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS.................................... 34 Hình 4.7 Hình khuếch đại gen Pr1 ..................................................................... 36 Hình 4.8 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự gen Pr1 ...................................................................... 39 Hình 4.9 So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1 ................................................. 41 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề. Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất nông nghiệp ngƣời nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị trƣờng xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên việc sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lƣợng ngày càng tăng đã và đang ảnh hƣởng nặng nề đến môi trƣờng, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lƣợng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Trƣớc thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng. Một trong những phƣơng pháp đó là kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc để phòng trừ và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại một cách hiệu quả và an toàn hơn. Trong các loại vi sinh vật gây hại cho côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm Metarhizium anisopliae-một trong những loài có đặc tính diệt côn trùng mạnh nhất. Trên thế giới nấm Metarhizium anisopliae là đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều công trình khoa và đã đƣợc thƣơng mại hóa từ lâu – nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại côn trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. 2 Trƣớc đây việc nghiên cứu về đa dạng sinh học chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá hình thái nên còn nhiều hạn chế. Ngày nay với sự ra đời của nhiều kĩ thuật mới nhƣ kĩ thuật PCR và những ứng dụng từ PCR nhƣ RAPD, RFLP, AFLP, Southern blot, Sequence v.v.. đã giúp cho quá trình nghiên cứu nhanh và chính xác hơn.Tuy nhiên những nghiên cứu nhƣ vậy ở nƣớc ta còn rất ít. Xuất phát từ những đặc điểm trên, đƣợc sự cho phép và phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA- ITS “. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài. 1.2.1.Mục tiêu Nghiên cƣ́u sƣ ̣đa daṇg di truyền của nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ phân lâp̣ trên nhiều đối tƣơṇg cây trồng khác nhau ở các tỉnh th ành trên cả nƣớc dƣạ vào trình tƣ ̣của gen gây đôc̣ Pr1 và vùng rDNA-ITS. 1.2.2. Yêu cầu đề tài. - Kiểm tra DNA đƣơc̣ ly trích tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u. - Xác định gen gây độc Pr1 và vùng rDNA-ITS bằng kỹ thuâṭ PCR. - Xác định trình tự gen Pr1 và vùng rDNA -ITS và tìm sƣ ̣khác biêṭ về trình tƣ ̣ giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu. Nấm Metarhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Điṇh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Bảng 2.1: Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Kingdom (Giới) Fungi Phylum (Ngành) Ascomycota Class (Lớp) Sordariomycetes Order (Bộ) Hypocreles Family (Họ) Clavicipitaceae Genus (Giống) Metarhizium Species (Loài) Metarhizium anisopliae Nấm này đƣợc Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì. Nấm thƣờng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong tự nhiên. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát tri