Khóa luận Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP hỗ trợ chẩn đoán sớm bệnh ung thư tế bào gan ở người

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Liên Trưởng Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang và TS. Đỗ Thị Thảo Trưởng Phòng Thử Nghiệm Sinh Học – Viện Khoa Học Công Nghệ VIệt Nam. Đó là những người thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bài khóa luận này. Đồng thời tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu của các chị tại Phòng thử nghiệm sinh học – Viện CNSH đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi hoàn thành phần lớn nội dung bài khóa luận. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại Học Nông Lâm – Bắc Giang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và bổ ích trong suốt 3 năm học vừa qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Bắc Giang , ngày 23 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Triệu Đinh Tâm DANH MỤC VIẾT TẮT AFP Alpha-fetoprotein ATCC America type culture collection BSA Bovine Serum Albumin CFA Complete Freund’s Adjuvant CEA CarcinoEmbryonic Antigen DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’ Medium ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serium GTD Gestational Trophoblastic Disease HAT Hypoxanthine Aminopterin Thimidine HT Hypoxanthin Thimidine HCG Human Chorionic Gonadotropin IFA Incomplete Freund’s Adjuvant KTĐD Kháng thể đơn dòng LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrophotometer OD Optical desnity PBS Phosphat buffer PSA Prostate Specific Antigen PEG Polythylen Glycol WHO Tổ chức y tế thế giới MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THI vii PHẦN : MỞ ĐẦU 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC 2 4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH UNG THƯ NÓI CHUNG VÀ ALPHA-FETOPROTEIN 3 1.1.1. TÌM HIỂU VỀ BỆNH UNG THƯ 3 1.1.1.1. Giai đoạn khởi đầu 5 1.1.1.2.Gai đoạn phát triển 6 1.1.1.3. Giai đoạn ung thư di căn 7 1.1.2.ALPHA – FETOPROTEIN (AFP) 7 1.1.2.1 Dấu ấn ung thư (tumor marker) và AFP 7 1.1.2.2. Bản chất và nguồn gốc của alpha-fetoprotein 9 1.1.2.2.1. Tình hình ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP để chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan ở nước ngoài và trong nước 10 1.2. GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH VÀ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 11 1.2.1. MIỄN DỊCH HỌC VÀ KHÁNG NGUYÊN 11 1.2.1.1. Các khái niệm về miễn dịch học 11 1.2.1.1.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên (Natural immunity) 11 1.2.1.2. Hệ thống các cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch 14 1.2.1.2.1. các cơ quan dạng lympho 14 1.2.1.2.2. Tế bào miễn dịch 15 1.2.1.3. Giới thiệu về kháng nguyên (Antigen) 16 1.2.1.3.1. khái niệm kháng nguyên 16 1.2.1.3.2 Những đặc tính của kháng nguyên 16 1.2.1.3.3. Phân loại kháng nguyên dựa vào đặc tính và điều kiện kháng nguyên 17 1.2.1.3.4. Điều kiện để kháng nguyên có tính miễn dich 18 1.2.1.4. Kháng thể và phản ứng kháng nguyên – kháng thể 19 1.2.1.4.1. Khái niệm kháng thể (Antibody) 19 1.2.1.4.2. Cấu trúc của kháng thể 19 1.2.1.4.3. Vai trò của kháng thể 21 1.2.1.4.4.Quy lụât hình thành kháng thể dịch thể đặc hiệu 23 1.2.1.4.5. Phản ứng kháng nguyên – kháng thể 23 1.2.2. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 24 1.2.2.1. Vài nét lịch sử 24 1.2.2.2. khái niệm về kháng thể đơn dòng 25 1.2.2.3. Ứng dụng của kháng thể đơn dòng 26 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28 2.1.1. Động vật thí nghiệm 28 2.1.2. Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma) của người 28 2.1.3. Thiết bị thí nghiệm 28 2.1.4. Hóa chất thí nghiệm 28 2.1.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1.Gây miễn dịch cho chuột 32 2.3.2.Phương pháp lấy đại thực bào 32 2.3.3.Phương pháp đếm tế bào 33 2.3.3.1. Chuẩn bị Trypan blue 0,4% 33 2.3.3.2. Đếm tế bào 33 2.3.4. Phương pháp lấy tế bào LymphoB của tế bào chuột 33 2.3.5 Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X 34 2.3.5.1. Đánh thức và nhân nuôi tế bào Sp 2/0 và P3X 34 2.3.5.2. Bảo quản tế bào trong Nito lỏng 34 2.3.6. Dung hợp Tế bào và tách dòng 35 2.3.6.1. Dung hợp 35 2.3.6.2. Tách dòng 35 2.3.7.Phương pháp ELISA 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYÊN AFP 37 3.2. KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP 39 3.3. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG AFP 43 3.4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 3.4.1 Kết Luận 51 3.4.2 Đề Nghị 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột với kháng nguyên AFP 37 Bảng 3.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP trên 2 dòng tế bào myeloma 42 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP 44 Bảng 3.4. Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương tính 47 Bảng 3.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào 50 DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THI Hình 1.1. Sơ đồ giai đoạn khởi đầu 6 Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư 7 Hình 1.3 a Cấu trúc điển hình của một kháng thể 19 1.3 b Bề mặt của kháng thể IgG 19 Hình 1.4. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 20 Hình 1.5. Các độc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể 21 Hình 1.6.Các độc tố trên bị trung hòa bởi kháng thể 22 Hình 1.7. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau 26 Hình 1.8. Kháng thể đơn dòng, liên kết với epitope đặc hiệu 26 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào Sp2/0 và P3X, độ phóng đại 10x20 40 Hình 3.2. Tế bào Lympho B và tế bào Sp2/0 dung hợp và phát triển trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20 41 Hình 3.3. Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển, độ phóng đại 10×20 và 10×10 45 Biểu đồ 3.1. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các chuột thí nghiệm bằng phương pháp ELISA 38 PHẦN : MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ung thư là bệnh rất nguy hiểm, mỗi năm có hơn 6 triệu người chết vì bệnh ung thư, 1.4 triệu ca ung thư mới được chẩn đoán trên thế giới. Theo đánh giá của Tổ chức y tế thế giới (WHO), trong 20 mươi năm tới các con số trên sẽ gia tăng và lên đến 10 triệu trường hợp tử vong và trên 16 triệu ca ung thư mới. Ở Việt Nam, bên cạnh các bệnh nhiễm khuẩn và suy dinh dưỡng ngày càng giảm dần, thì bệnh ung thư, bệnh tim mạch, tâm thần đang có nguy cơ gia tăng. Các loại ung thư hay gặp ở nước ta là ung thư phổi, dạ dày, vú, gan, vòm họng, đại trực tràng, hạch bạch huyết, tử cung, buồng trứng…. Trong khi ở nhiều nước, chương trình sàng lọc phát hiện sớm ung thư đạt kết quả tốt, đã góp phần chữa khỏi hơn 50% bệnh nhân ung thư thì ở nước ta đa số người bị ung thư khi được chẩn đoán đã ở giai đoạn muộn, tỉ lệ chữa khỏi bệnh còn rất thấp. Các loại ung thư thường gặp tính chung cả 2 giới nam và nữ, ước tính hàng năm trên toàn cầu cho thấy khoảng 10,9 triệu ca ung thư mới mắc và khoảng 6,7 triệu người chết vì ung thư (2002) Tại VN, hàng năm có khoảng 100.000-150.000 trường hợp mới mắc ung thư và khoảng 70.000 người chết do ung thư. Ở VN, qua nghiên cứu ở TPHCM và Hà Nội cho thấy 10 loại ung thư thường gặp ở nam và nữ là: ung thư gan, ung thư phổi. ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư bạch cầu, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến giáp…[34]. Giai đoạn mắc bệnh ung thư thì người bệnh thường không phát hiện được, đến khi người bệnh phát hiện được thì thường ở giai đoạn nặng và không thể cứu chữa được. Đôi khi các bác sĩ còn chẩn đoán sai dẫn đến việc chữa và trị đi sai hướng dẫn tới bệnh nhân chịu hậu quả rất nặng. Việc chẩn đoán chính xác và phát hiện sớm là điều rất quan trọng cho việc điều trị. Có nhiều phương pháp chẩn đoán nhưng mỗi phương pháp lại có hạn chế nhất định trong việc xác định chính xác loại ung thư để điều trị cho thích hợp. Hiện nay, để chẩn đoán sớm được bệnh một cách nhanh chóng và chính xác, người ta sử dụng phương pháp chẩn đoán bằng kháng thể đơn dòng. Phương pháp này có đặc điểm là rất đặc hiệu với kháng nguyên tức là nó chỉ nhận biêt duy nhất một loại kháng nguyên khi đưa vào cùng một lúc với các kháng nguyên khác. Nên kết quả sẽ không bị nhầm lẫn mà ngược lại là độ chính xác lại rất cao. Vì vậy, để góp phần vào công tác chẩn đoán kịp thời, nhanh chóng chính xác và đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp do đó chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP hỗ trợ chẩn đoán sớm bệnh ung thư tế bào gan ở người” 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạo được dòng tế bào lai lai sinh kháng thể đơn dòng (mAb) kháng đặc hiệu alpha-fetoprotein (AFP) 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC Tìm ra tính đặc hiệu của kháng thể ở nồng độ thích hợp trong việc sản xuất kháng thể đơn dòng để tạo bộ kít chẩn đoán bệnh. 4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN Có ý nghĩa lớn trong việc xác định và chẩn đoán sớm được bệnh ung thư để sớm đưa ra phương pháp điều trị thích hợp Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH UNG THƯ NÓI CHUNG VÀ ALPHA-FETOPROTEIN 1.1.1. TÌM HIỂU VỀ BỆNH UNG THƯ Ung thư là căn bệnh nguy hiểm và khó chữa trị, hơn nữa với số lượng người mắc bệnh ngày một tăng cao, ung thư thực sự là mối nguy hại lớn ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng, tới sự phát triển kinh tế và xã hội. theo báo cáo nhiều nhất của bộ y tế thế giới WHO thì ung thư đang dần vượt qua tim mạch để trở thành căn bệnh gây tử vong cao nhất trên toàn thế giới. Trong tổng số 58 triệu người chết trong năm 2005 thì số lượng người chết vì căn bệnh ung thư chiếm 7,6 triệu(tức là khoảng 13%) [3]. Trong số tử vong này, chiếm hơn 70% là bệnh nhân thuộc về các nước đang phát triển và có mức thu nhập thấp.WHO cũng dự đoán khoảng 9 triệu người sẽ chết vì căn bệnh này trong năm 2005 và số lượng người mắc bệnh mới và chết sẽ tiếp tục tăng trong các năm tiếp theo [32]. Việt nam là nước đang phát triển và cũng không phải là ngoại lệ. Chúng ta đang phải đối mặt với căn bệnh nguy hiểm này. Bệnh ung thư đang hoành hành khắp mọi miền đất nước bà ngày càng phổ biến, với ước tính mỗi năm có 150 ngàn ca mắc mới và 75 ngàn ca tử vong, gấp 7 lần số người chết do tai nạn giao thông. Riêng với căn bệnh ung thư gan thì các số liệu thống kê cho thấy Việt Nam là nước có tỷ lệ người mắc ung thư gan đứng thứ 2 thế giới [1,6]. Ung thư là tên dùng chung để gọi một nhóm bệnh gồm khoảng 200 loại khác nhau về nguồn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn, khả năng và cách thức chữa trị nhưng đều có chung một đặc điểm nổ bật là sự tăng sinh vô hạn không thể kiểm soát, có thể di căn tồn tại xâm lấn và phát triển của tế bào ung thư [3, 5, 14]. Ung thư là căn bệnh rất phổ biến, được biết đến và nghiên cứu chủ yếu trên cơ thể con người. Ung thư có thể xuất phát từ một tế bào ban đầu của một tổ chức nào đó nằm trên cơ thể. Như vậy, có thể nói ung thư là căn bệnh của tế bào và rất đa dạng về căn nguyên, cách phòng bệnh, chẩn đoán và điều trị. Quá trình phát triển từ một tế bào ung thư ban đầu thành một khối u ung thư và đe dọa tính mạng người bệnh trải qua nhiều giai đoạn [14]. Giai đoạn đầu là quá trình hình thành tế bào ung thư khởi phát do ảnh hưởng của các tác nhân nội bào hay ngoại bào nào đó. Diễn biến tiếp theo là quá trình phân chia liên tục không ngừng của tế bào ung thư này thành một khối u được gọi là quá trình phát triển bệnh. Các tế bào ung thư trong khối u sẽ tiếp tục tăng sinh, tự mất đi các thụ cảm thể nhận biết giới hạn không gian phát triển so với các tế bào lân cận, sản xuất ồ ạt các cytokine (cell signals) và các enzym protease dẫn tới phá hủy màng đệm lót và môi trường ngoại bào bao quanh khiến chúng có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di chuyển tới các cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổ chức và các cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổ chức. Quá trình này gọi sự di căn (metastatic process). Các tế bào ung thư chèn ép hay di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống trong cơ thể như não, phổi, gan, thận v..v.. khiến bệnh nhân tử vong [12, 14, 25]. Các số liệu thống kê của WHO cho thấy 40% trường hợp ung thư có thể phòng tránh được . Và nếu được phát hiện ở giai đoạn sớm trước khi tế bào ung thư di căn thì bệnh nhân ung thư hoàn toàn có thể sống sót và khỏi bệnh. Vì thế, phát hiện ra sự hình thành khối tế bào ác tính ở giai đoạn sớm sẽ là điều kiện tiên quyết để cứu sống người bệnh. Thế nhưng việc phát hiện sớm ung thư là rất khó khăn. Để chẩn đoán bệnh ung thư, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết và phương pháp hóa sinh. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Ví dụ phương pháp sinh thiết, giải phẫu bệnh cung cấp cho chúng ta thông tin chính xác về khối u, nhưng hạn chế về mặt tâm lý, đau khi chọc hút sinh thiết và có thể kích thích di căn. Phương pháp hóa sinh “enzym-miễn dịch” áp dụng các thành tựu nghiên cứu trong ung thư học về các dấu hiệu ung thư (tumor marker) để chẩn đoán sớm căn bệnh. Phương pháp này phát hiện chính xác các tumor marker, thông qua mẫu máu hoặc nước tiểu [25]. Việc thu mẫu máu hoặc nước tiểu để xét nghiệm sẽ dễ dàng hơn sinh thiết, giải phẫu bệnh mà cũng cho kết quả chính xác phù hợp với bản chất các loại ung thư. * Qúa trình hình thành và phát triển tự nhiên của ung thư Mỗi loại ung thư đều có sự tiến triển khác nhau, tuy nhiên nếu ung thư không được điều trị thì sẽ diễn biến qua các giai đoạn sau: 1.1.1.1. Giai đoạn khởi đầu a. Bước khởi đầu Thường xảy ra rất nhanh, sau khi các tế bào tiếp xúc với các tác nhân gây ung thư: tác nhân vật lý, tác nhân hóa học, tác nhân virus. Các tác nhân này gây ra thương tổn DNA của tế bào không hồi phục. b. Giai đoạn thúc đẩy Do tiếp xúc liên tục, kéo dài với các chất gây ung thư làm ổn định và duy trì thương tổn đầu tiên. Bước khởi đầu và giai đoạn thúc đẩy chúng ta chỉ biết được qua mô hình thí nghiệm và những nghiên cứu về dịch tễ ung thư ở người. c. Giai đoạn phát triển Các tế bào nhân lên không kiểm soát được, phát triển độc lập, mất khả năng biệt hóa, xâm lấn cục bộ và cho di căn. Khởi đầu  Thúc đẩy  Phát triển   Hóa chất   Phóng xạ   Virus   Hình 1.1. Sơ đồ giai đoạn khởi đầu Để dự phòng giai đoạn khởi đầu sinh ung thư người ta phải bảo vệ tránh tiếp xúc với các tác nhân gây ung thư như thuốc lá, benzol, nhiều loại hóa chất khác nhau, tia phóng xạ, virus v.v. 1.1.1.2.Gai đoạn phát triển Sự phát triển của bệnh ung thư giải thích được bản chất của bệnh ung thư là gì: khối u phát triển cục bộ tại chỗ, xâm lấn tại vùng và cho di căn toàn thân. Khi phát triển ung thư đã xảy ra, có nhiều biện pháp để chống lại sự phát triển đó: + Sàng lọc và điều trị các thương tổn tiền ung thư. + Sàng lọc và điều trị những ung thư kích thước còn nhỏ (chủ yếu bằng phẫu thuật hoặc tia xạ). + Điều trị tích cực các ung thư đang còn tại chỗ (thường kết hợp với điều trị hỗ trợ hóa trị liệu hoặc nội tiết trị liệu).
Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư 1.1.1.3. Giai đoạn ung thư di căn Di căn ung thư là tình trạng các tế bào ung thư tách rời ra khỏi u nguyên phát để đến cư trú và phát triển thành khối u ở cơ quan khác qua các đường khác nhau như đường bạch huyết, đường máu, đường kế cận v.v. Ví dụ như khi di căn theo đường bạch huyết thì khối u tiến đến thành bạch huyết, tế bào ung thư xâm lấn nhanh chóng qua thành bạch huyết và được hệ thống lưu thông bạch huyết mang tới trạm hạch đầu tiên và nếu không bị tế bào miễn dịch ở hạch bạch huyết tiêu diệt chúng sẽ tiếp tục di chuyển tới các vị trị khác trong cơ thể tạo quá trình di căn. Khi các khối u ung thư đã di căn thì việc điều trị trở nên rất khó khăn và nguy cơ tử vong của bệnh nhân là rất lớn. Vì thế, việc phát hiện sớm bệnh ung thư ở giai đoạn đầu hoặc giai đoạn phát triển sẽ là điều kiện tiên quyết để cứu sống bệnh nhân. 1.1.2.ALPHA – FETOPROTEIN (AFP) 1.1.2.1 Dấu ấn ung thư (tumor marker) và AFP Khi các tế bào ung thư xuất hiện, một hay một số cơ chất sinh học cũng sẽ xuất hiện trong cơ thể. Chúng có thể do các tế bào ung thư tạo ra hoặc do cơ thể sinh ra để đáp ứng lại sự thay đổi trong cơ thể bởi sự xuất hiện của tế bào ung thư. Các cơ chất này được gọi chung là các tumor marker (nay gọi tắt là các marker) [8, 33]. Các nhà khoa học hy vọng trong tương lai các marker này sẽ giúp phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm và do đó sẽ cứu sống được hàng triệu người. Vì thế, rất nhiều nghiên cứu đang hướng tới tìm ra các marker đặc trưng cho từng loại ung thư để có thể phát hiện sớm căn bệnh này. Tumor marker gồm những chất có bản chất như: Là chất do tế bào ung thư sinh ra, được đưa vào máu như AFP, CEA (carcinoembryonic antigen), CA-125, CYFRA 21-1 v.v. Là hormon như HCG (human chorionic gonadotropin) hoặc là chất chuyển hóa như CPR (Protein C hoạt động), LDH, GGT. Các tumor marker có một số đặc điểm sau: Đặc hiệu cho loại ung thư Nồng độ marker tỷ lệ với tình trạng, diễn biến của bệnh. Phát hiện được từ giai đoạn sớm của bệnh. Vì có những ưu điểm như trên nên các marker hiện đang được nghiên cứu nhiều. Marker đầu tiên được sử dụng để phát hiện ung thư là human chorionic gonadotropin (HCG). Đây là một cơ chất phổ biến ở phụ nữ có thai. Những phụ nữ không có thai mà có hàm lượng HCG cao trong máu có thể là dấu hiệu của ung thư tử cung gọi là gestational trophoblastic disease (GTD). Tuy nhiên, vào năm 1965, bộ sinh phẩm (Kit) đầu tiên trên thế giới phát hiện marker ung thư trong mẫu huyết thanh lại là để phát hiện carcinoembryonic antigen (CEA) đặc trưng cho ung thư ruột kết [34]. Một trong số các marker rất hữu ích là alpha-fetoprotein (AFP). Marker này được sử dụng để hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư tế bào gan. Ở người bình thường, hàm lượng AFP rất thấp, dưới mức 10 ng/ml, theo một số báo cáo là ≤ 5,4 ng/ml [27, 28]. Tuy nhiên, hàm lượng này có thể tăng lên bất thường trong một số bệnh về gan như viêm gan B, viêm gan C v.v. nhưng hiếm khi vượt quá 100 ng/ml. Khi hàm lượng này tăng cao tới một mức nhất định nào đó (trong trường hợp này là > 100 ng/ml) thì các bác sĩ có thể nghi ngờ là ở người bệnh đã xuất hiện khối u ung thư ở gan. Trong những trường hợp hàm lượng AFP vượt mức 4000 ng/ml bác sĩ sẽ khằng định bệnh nhân bị ung thư gan tiên lượng xấu mà không cần tiến hành xét nghiệm sinh thiết [10, 17, 28]. AFP cũng rất hữu ích trong việc kiểm tra hiệu quả chữa trị cho bệnh nhân ung thư tế bào gan. Nếu khối u được cắt bỏ hoàn toàn sau phẫu thuật thì hàm lượng AFP sẽ trở lại bình thường và ngược lại, nếu hàm lượng này tăng cao trở lại có nghĩa là khối u lại phát triển [8, 10]. 1.1.2.2. Bản chất và nguồn gốc của alpha-fetoprotein AFP là một glycoprotein với cấu trúc gồm 590 amino acid và một phân tử carbohydrate. AFP là một protein quan trọng của huyết tương và do túi phôi của phôi thai hay theo một số tài liệu thì do gan của phôi sản sinh ra. Protein này được cho là bản sao của albumin huyết thanh. Gen mã hóa AFP và albumin cùng có mặt ở vị trí đối diện trên nhiễm sắc thể số 4. AFP được tìm thấy ở các dạng cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 và gắn kết với nguyên tố đồng (Cu), Niken (Ni), axit béo và bilirubin [23,28] Trong giai đoạn phôi thai, AFP gắn với hormone estradiol và được định lượng thông qua máu của người mẹ hoặc dịch màng ối. Trường hợp hàm lượng AFP tăng cao bất thường thì nhiều khả năng là phôi thai có vấn đề liên quan đến sự phát triển của hệ thần kinh hay thoát vị rốn hoặc hội chứng Down. Sau khi được sinh ra, hàm lượng AFP của bé mới sinh giảm dần cho tới khi đạt mức chuẩn của người lớn bình thường trong khoảng từ 8-12 tháng tuổi [15,33]. Hàm lượng AFP bình thường rất thấp (5-10 ng/Ml) và đến nay chức năng của nó trong cơ thể người trưởng thành vẫn chưa được xác định. Người ta cho rằng AFP có vai trò như một chất điều hòa tăng