Khóa luận Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân DS. Nguyễn Thị Thu Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Nguyễn Thị Thu Phương là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên của bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Phùng Thị Ngọc Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC .................................................................... 2 1.1.1. Định nghĩa .................................................................................................. 2 1.1.2. Vai trò ......................................................................................................... 3 1.1.3. Probiotic từ bào tử ...................................................................................... 4 1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii .................................................................. 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 6 1.2.2. Cấu trúc bộ gen ........................................................................................... 6 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa ...................................................................................... 7 1.2.4. Đặc điểm sinh thái ...................................................................................... 7 1.2.5. Điều kiện nuôi cấy ...................................................................................... 7 1.2.6. Ứng dụng của B. clausii ............................................................................. 7 1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii .................................................. 8 1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN .................................................................................. 8 1.3.1. Quá trình hình thành bào tử ...................................................................... 11 1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng ............................................. 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ............................................................................ 13 2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 13 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu...................................................... 14 2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 14 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 15 2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất ...................... 15 2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản ................................................................. 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 15 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina ............................................ 15 2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng ..................................... 15 2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật .............. 15 2.3.4. Phương pháp thu sinh khối ....................................................................... 16 2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử .......................... 16 2.3.6. Phương pháp đông khô ............................................................................ 17 2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska .................................... 17 2.3.8. Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục...18 2.3.9. Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen............ 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 21 3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất ............ 21 3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất ..... 21 3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy .............................................................................................................. 23 3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản ............................................................... 26 3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy ............................................. 26 3.2.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản B. clausii ............................................ 30 3.2.3. Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9% ... 33 3.2.4. Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm tạo thành ................................................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 38 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribonucleic ATCC : American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) B. cereus : Bacillus cereus B. clausii : Bacillus clausii B. subtilis : Bacillus subtilis Cfu : Colony - Forming Units (số đơn vị khuẩn lạc) DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) MT1 : Môi trường canh thang OD : Optical Density (mật độ quang) TB : Tế bào V /P : Vòng/phút VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14 3.1 Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska 22 3.2 Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ glucose khác nhau 24 3.3 Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi xử lý 27 3.4 Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska 28 3.5 Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska sau các khoảng thời gian bảo quản 31 3.6 Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1 tháng bảo quản 32 3.7 Số lượng B. clausii sống sót tại các thời điểm trong quá trình bảo quản 34 3.8 Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các nồng độ pha loãng 36 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang 1.1 Sản phẩm chứa B. clausii 5 1.2 Vi khuẩn B. clausii 6 1.3 Cấu tạo bào tử vi khuẩn 10 1.4 Sự hình thành bào tử 11 2.1 Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục 16 3.1 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu thụ của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy 24 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau 28 3.3 Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng) 32 3.4 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên số lượng VSV sau các khoảng thời gian bảo quản 34 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên phục vụ cuộc sống đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các sản phẩm men vi sinh (probiotic). Các chủng probiotic được sử dụng rất đa dạng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis bởi các ưu điểm riêng biệt của nó. Đó là khả năng sinh bào tử, bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để chúng có thể tồn tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng thành sẽ bị giết chết [28]. Chế phẩm Enterogermina là một chế phẩm chứa Bacillus clausii dưới dạng bào tử đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy, khi ở dạng bào tử, lợi khuẩn B. clausii có thể an toàn vượt qua môi trường acid khắc nghiệt của dịch dạ dày và đến được ruột với tỷ lệ sống cao hơn hẳn các loại lợi khuẩn thông thường khác. Men vi sinh dạng bào tử lợi khuẩn B. clausii sẽ giúp bổ sung các vi khuẩn có lợi lập lại sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, giúp phòng ngừa và điều trị hiệu quả các rối loạn tiêu hóa. Trên thực tế, việc sản xuất ra nguyên liệu chứa bào tử gặp rất nhiều vấn đề. Đó là phải thu được lượng bào tử tối đa và tinh khiết không còn lẫn tế bào chất hay xác tế bào từ sinh khối thu được sau khi nuôi cấy. Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử” được thực hiện để giải quyết vấn đề trên với 2 mục tiêu sau: 1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất. 2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, "biotic" hay "biosis" từ chữ "life" là đời sống, và "pro" là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích [27], [40]. Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác [41]. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ [41]. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [35]. Theo định nghĩa của FAO và WHO năm 2002 “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức 3 khỏe vật chủ” [32], [41]. Nhưng không phải tất cả các vi sinh vật đều có thể đến được vị trí tác dụng tạo ra hiệu quả. Trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các sản phẩm probiotic phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào VSV sống cho đến hết ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị [22], [32]. 1.1.2. Vai trò  Điều trị một số bệnh tiêu hóa ở người - Ngăn chặn bệnh tiêu chảy: Probiotic được chứng minh là có tác dụng trong 5 loại tiêu chảy: tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, do nhiễm khuẩn, do nhiễm virus, tiêu chảy ở người du lịch và tiêu chảy do không dung nạp lactose. Hai tác nhân có hiệu quả với những bằng chứng rõ ràng trong việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn Lactobacillus rhammosus GG và nấm men Saccharomyces boulardii [33]. Các tác nhân khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum [12], [33]. - Tác dụng lên Helicobacter pylori: Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm rất phổ biến trong dạ dày. Khoảng 50% dân số thế giới bị nhiễm vi khuẩn này. Sự tồn tại lâu dài của vi khuẩn này trong dạ dày có thể là yếu tố tiềm tàng gây ung thư dạ dày [6]. Đã có nhiều phương pháp dung để loại bỏ sự nhiễm H. pylori, trong đó có việc sử dụng các chế phẩm có hoạt tính probiotic. Liệu pháp sinh học này thường được sử dụng như một chất bổ sung cho các liệu pháp sử dụng kháng sinh truyền thống trong việc điều trị bệnh. Các thử nghiệm y khoa đã xác nhận tỷ lệ chết của vi khuẩn H. pylori tăng lên khi điều trị bằng phương pháp kháng sinh kết hợp với probiotic. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzym của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu 4 những loại thức ăn có chứa nhiều lactose, làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại [26].  Hạ cholesterol máu: Các bệnh về van tim thường liên quan đến lượng cholesterol cao trong huyết thanh. Các nghiên cứu của Hepner và cộng sự (1979) khi nghiên cứu những người khỏe mạnh không có tiền sử mắc bệnh tim mạch ăn bổ sung yogurt có chứa Lactobacillus acidophilus kết quả cho thấy nồng độ cholesterol trong huyết thanh giảm rõ rệt.  Chống lại tác nhân gây ung thư: Tác dụng chống khối u của probiotic có thể do một số cơ chế sau: gắn với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế enzym tiền ung thư như nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-glucosidase, chất giải phóng flavonoid, sản xuất các chất chống oxi hóa [38].  Một số tác dụng khác + Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng của cơ thể như (acid folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12). + Giảm nguy cơ sỏi thận do ảnh hưởng đến sự bài tiết oxalat trong nước tiểu, do đó giảm sự hình thành sỏi [24]. + Tăng cường miễn dịch: vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (tăng sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc hiệu – miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, tăng số lượng và tăng hoạt động của tế bào diệt tự nhiên) [27], [32]. 1.1.3. Probiotic từ bào tử Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, 5 nhiều sản phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis. Sản phẩm đầu tiên chứa bào tử của vi khuẩn B. clausii là Enterogermina được sản xuất tại Ý (năm 1958) [21]. Các ưu điểm của probiotic từ bào tử: + Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống. + Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày [14], [36], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [39]. Chính vì vậy một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng. + Kháng đa kháng sinh (đặc biệt là Bacillus clausii trong chế phẩm Enterogermina) [30], [37]. + Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn, các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau. Hình 1.1. Sản phẩm chứa B. clausii 1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii Theo khóa phân loại của Bergey (1994) B. clausii thuộc: 6 Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus clausii Bacillus clausii cũng như các loài trong chi Bacillus có thể hình thành bào tử, có nghĩa là tạo ra một vách dày bao quanh ADN và các cấu trúc nội tế bào của chúng. Do đó chúng rất khỏe mạnh và không bị phá hủy bởi nhiệt độ khắc nghiệt, hóa chất, các yếu tố môi trường, thậm chí một số loại bức xạ. Đây là đặc tính rất tốt để sử dụng trong công nghiệp và bào chế dược phẩm. 1.2.1. Đặc điểm hình thái Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục. Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm [9]. Hình 1.2. Vi khuẩn B. clausii 1.2.2. Cấu trúc bộ gen B. clausii có cấu trúc bộ gen là một vòng tròn nhiễm sắc thể, nhiễm sắc thể này gồm 4.303.871 nucleotid, gen này chứa 4.204 gen, trong đó 4.096 là protein mã hóa và mã hóa cho 96 ARN. Các nucleotid loại cytosin và guanin trong ADN của B. clausii chiếm tỷ lệ cao nhất so với Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM-K16 và chiếm khoảng 42,8 - 45,5% với chủng DSM 8716 [9], [29]. 7 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa Vi khuẩn B. clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit [29]. 1.2.4. Đặc điểm sinh thái B. clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất sét (B. clausii ATCC 31084, B. clausii DSM 8716) [29]. Ngoài ra có thể tìm thấy B. clausii ở trong nước, trong bùn (B. clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) [13]. 1.2.5. Điều kiện nuôi cấy B. clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình nuôi cấy cần cấp khí. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC [29]. Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích hợp khác nhau, ví dụ: chủng B. clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30ºC, chủng B. clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40ºC Khoả