Khóa luận Nuôi cấy bacillus subtilis thu nhận α - Amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng Nguyễn Thanh Thủy Nguyễn Nhƣ Nhứt Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã luôn trăn trở, lo lắng và động viên để tôi có đƣợc ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn đến tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng và anh Nguyễn Nhƣ Nhứt đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Cảm ơn các anh và các bạn tại phòng sinh hóa ứng dụng của trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Cảm ơn Hồng Vy và Phƣơng Uyên, hai ngƣời bạn thân nhất của tôi đã chia xẻ và giúp đỡ tôi trong 4 năm học tại trƣờng. iv TÓM TẮT Nguyễn Thanh Thủy, Đại học Nông Lâm TP. HCM Đề tài nghiên cứu “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”, thực hiện tại phòng sinh hóa và ứng dụng của trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ 19/03/2007 – 19/07/2007. GVHD: ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng ThS. Nguyễn Nhƣ Nhứt Đối tƣợng nghiên cứu là α-amylase của Bacillus subtilis Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hoà tan trong nƣớc, phƣơng pháp Heinkel xác định hoạt độ α-amylase để khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% và (NH4)2SO4, khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase là 48 giờ. - Tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% tốt nhất là 1 thể tích dịch chiết enzyme và 3 thể tích cồn. Thời gian tủa là 15 phút. - pH và nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân của chế phẩm α-amylase là 6,0 và 55oC. - Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất từ sự thủy phân bột năng 10%. v ABSTRACT NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from 03/2007 to 09/2007. We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, α- amylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis ability and dextrin production of α-amylase product. Result experiments showed that: - α-amylase activity was hightest at 48h incubation. - Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for precipitation was 1:3. - Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were respective 55 degree C and 6,0. - α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid. vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Abstract ....................................................................................................................... v Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ...................................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ .................................................................................................. xii Danh sách các đồ thị ................................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ ............................................................................................... xii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH...................................................................................................... 2 1.3. YÊU CẦU ........................................................................................................ 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. BACILLUS SUBTILI ....................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn .................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại ................................................................................................... 6 2.1.3. Bộ gen ....................................................................................................... 6 2.1.4. Ứng dụng .................................................................................................. 7 2.2. ALPHA-AMYLASE ....................................................................................... 8 2.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 8 2.2.2. Phân loại, danh pháp ................................................................................ 8 2.2.3. Cấu trúc phân tử ....................................................................................... 8 2.2.4. Tính chất ................................................................................................... 9 2.2.5. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 10 2.2.6. Ứng dụng ................................................................................................ 11 2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT ..................................... 12 vii 2.3.1. Nuôi cấy bề mặt ...................................................................................... 12 2.3.2. Nuôi cấy chìm ........................................................................................ 12 2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME .............................................................. 13 2.5. DEXTRIN ...................................................................................................... 13 2.5.1. Phân loại ................................................................................................. 14 2.5.2. Tính chất ................................................................................................. 14 2.5.2.1. Độ nhớt ........................................................................................ 15 2.5.2.2. Độ pH .......................................................................................... 16 2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin .......................................................... 16 2.5.2.4. Độ hòa tan .................................................................................... 16 2.5.2.5. Màu sắc ........................................................................................ 16 2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin ...................................................................... 17 2.5.4. Ứng dụng ................................................................................................ 18 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ......................................................................... 19 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 19 3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ................................................................... 20 3.3.1. Xác định mật độ tế bào ........................................................................... 20 3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp .................................................... 20 3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% .............................................. 20 3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ................................................................. 21 3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96% ....................................... 21 3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của α-amylase .......................................................................................................... 22 3.3.6.1. Nhiệt độ ...................................................................................... 22 3.3.6.2. pH ............................................................................................... 22 3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin ................................................ 22 3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các nguồn tinh bột. ..................................................................................................... 22 3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột ................. 22 3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp. ......................................... 23 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................. 23 viii Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY ....................................... 24 4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 ............................................................................................................ 25 4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% ................................................ 24 4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ............................................ 27 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% .. 28 4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE.......................................................... 29 4.4.1. Nhiệt độ .................................................................................................. 29 4.4.2. pH ........................................................................................................... 30 4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN ......... 31 4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT .................................................. 32 4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE ................. 32 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. subtilis Bacillus subtilis GH Glycosidic Hydrolase EC Enzyme Commission DAP Diamoni Phosphate MW Molecular Weight Da Dalton DE Dextrose equivalent CT Canh trƣờng dOD Delta optical density DCE Dịch chiết enzyme CPE Chế phẩm enzyme (đã sấy khô) CP tƣơi Chế phẩm enzyme tƣơi UI Unit International x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái Bacillus subtilis ........................................................................... 3 Hình 2.2. Bacillus subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử ........................................ 4 Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa ............................................................. 4 Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase ........................................................... 9 Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột ........................................... 11 Hình 2.5. Dextrin ....................................................................................................... 14 Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy .................................................... 25 Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ .............................................................. 25 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30 Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase ................................................................................. 36 Hình 4.5. Chế phẩm dextrin ...................................................................................... 36 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis .................................................. 5 Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis ................................................................... 6 Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin ..................................................................... 15 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ....................... 24 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................. 26 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................... 27 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ................ 28 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ................................. 29 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30 Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96% ........................................... 31 Bảng 4.8. Dextrin tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10% ......................... 32 Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin ................................................................................. 33 Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10% ................................ 33 Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15% ................................ 34 Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20% ................................ 35 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột .......................................... 17 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ...................... 25 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................ 26 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................. 27 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase .............. 28 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ............................... 29 Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ....................................... 31 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% ...................................... 31 Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% .............. 32 Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10% ............. 34 Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15% ............. 34 Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20% ............. 35 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose… Trƣớc đây, ngƣời ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lƣợng lớn α-amylase là rất cần thiết. Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị dinh dƣỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của thực phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm và công nghiệp bánh kẹo. Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản xuất dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hƣớng sản phẩm do tác dụng không đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền, lƣợng acid dƣ gây hƣ hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trƣờng. Mặc khác, dextrin thành phẩm có màu và vị đắng. Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên. 2 Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp và trong y dƣợc. Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”. 1.2. MỤC ĐÍCH Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của α- amylase và tinh bột để thu nhận dextrin. 1.3. YÊU CẦU - Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc. - Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất. Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dƣỡng có dạng hình que, kích thƣớc chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm. Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang. Hình 2.1. Bacillus subtilis (URL: Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thƣớc chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn đƣợc tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (Trần Đỗ Quyên, 2004). 4 Hình 2.2. B. subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử. Cấu trúc hình oval ở trung tâm là bào tử (URL: ec.europa.eu/research/success/images/0291b.jpg). Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cƣa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005). Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạ