Khóa luận Phân lập nấm fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dõng nấm tạo giberelin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. TS. Lê Đình Đôn không những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong trong nghiên cứu khoa học mà thầy còn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc sống. Những lời thầy nói, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi. Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105) khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài. Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phòng Hóa Lý và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. Toàn thể lớp CNSH 29 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007 Diệp Tuyết Châu ii TÓM TẮT LUẬN VĂN DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 08/2007. “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, tại Phòng bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Cây lúa là cây gắn liền với lịch sử hình thành và phát triển nước ta. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng hình thành và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Đặc biệt bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong hai năm gần đây trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long làm giảm năng suất đáng kể. Để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu sau: Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. Các kết quả đạt được: Phân lập được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von. Khuếch đại thành công vùng tef của 14 dòng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2 bằng kỹ thuật PCR. Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC. iii SUMMARY The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to 08/2007 at Nong Lam university. In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields. In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14 isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to identify GA3 but our experiment did not go as well as planned. iv MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................. i Tóm tắt luận văn ....................................................................................................... ii Summary ................................................................................................................. iii Mục lục .................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng, hình, sơ đồ ........................................................................... viii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von ................................................................................. 3 2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3 2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3 2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5 2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6 2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7 2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8 2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8 2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9 2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10 2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11 2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa ....................................................................... 13 v 2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13 2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14 2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14 2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14 2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15 2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15 2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15 2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16 2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16 2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16 2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20 2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC ...................................................... 20 2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR............................................................................. 20 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................... 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 22 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 23 3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ................................................................ 23 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm ........................................... 23 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ................................................................. 24 3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm ....................................................................... 25 3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử ...................................................................... 25 3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối ..................................................................... 25 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm ............................................................ 26 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 26 3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA ....................................................................... 26 vi 3.3.2.3 Định tính DNA ........................................................................................... 27 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích ...................................................................... 28 3.3.3 Khuếch đại vùng tef ...................................................................................... 28 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................. 28 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng ................................................................................... 29 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR ............................................................................ 29 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 ........................................................... 29 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 29 3.4.2 Phương pháp sản xuất GA3 .......................................................................... 30 3.4.3 Phương pháp trích GA3 ................................................................................. 30 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC ............................................................................. 31 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33 4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35 4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36 4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC .................................................................... 39 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH: acid acetic. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. BVTV: bảo vệ thực vật. bp: base pair. CHCl3 : chloroform. dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate. ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long. EtOAc: ethyl acetate. HPLC: high performance liquid chromatography. ITS: Internal Transcribed Spacer. GAs: giberelins. GA3: acid giberelic. Gf: Gibberella fujikuroi MP: mating population. PCR: polymerase chain reaction. PDA: potato dextrose agar. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. Rf: ratio of fronts. STT: số thứ tự. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. tef : translation elongation factor. TLC: thin-layer chromatography. Tm: melting temperature. UV: ultra violet. WA: water agar. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5 Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5 Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11 Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11 Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12 Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13 Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson ................. 15 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19 Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33 Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA ............................................ 33 Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34 Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35 Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35 Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 ........................... 37 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39 Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40 Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi .............................. 9 Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium ................................................................. 10 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 ................................................................................... 30 Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3 ................................................................... 31 Bảng 3.1 Các dòng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL ........ 23 Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR................................................................. 29 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nó được xem là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu của người Châu Á nói chung cũng như là người Việt Nam nói riêng. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này có thể do nhiều tác nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra. Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa có thể kể như lúa von, đạo ôn, khô vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm đòng ( và đã làm giảm năng suất đáng kể. Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100 năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài 2 Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và t