Khóa luận Phân tích Protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảng đường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học thực thụ. Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên. Tuy nhiên, hoàn thành tốt Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cố gắng của bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình, bạn bè đặc biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện Khóa luận. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Chi – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn những kiến thức khoa học mới khi làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Bích Nhi, ThS. Trần Thế Thành vì những đóng góp quý báu trong quá trình hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học và các thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Vũ Khắc Ngọc MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 2 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người 2 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người 2 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh 3 1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam 4 1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh 4 1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh 6 1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 7 1.2.1. Giới thiệu chung 7 1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE 7 1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE 9 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE 9 1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2. Hóa chất 15 2.1.3. Thiết bị 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh 16 2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau 16 2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford 17 2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18 2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 19 2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin 20 2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS 20 2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 21 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23 3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được 24 3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford 25 3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27 3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp 30 3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein 32 3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE 34 3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS 36 3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện 37 3.9.1. Haptoglobin 37 3.9.2. Apolipoprotein A (Apo) 38 3.9.3. Transthyretin (TTR) 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Trang Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư 5 Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 18 Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC 20 Bảng 5. Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn 26 Bảng 6. Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford 27 Bảng 7. Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian 28 Bảng 8. Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp Bradford 33 Bảng 9. Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt bằng phương pháp 2DE-LC-MS/MS 36 DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Trang Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh 3 Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip 8 Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein 10 Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau 11 Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau 13 Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein 14 Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 22 Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23 Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt 24 Hình 10. Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford 26 Hình 11. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 27 Hình 12. Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt 29 Hình 13. Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó 30 Hình 14. Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7 31 Hình 15. Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA 33 Hình 16. Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10 35 Hình 17. Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 37 Hình 18. Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762 38 Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762 38 Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 39 Hình 21. Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465 40 Hình 22. Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465 40 Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 41 Hình 24. Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953 41 Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 42 MỞ ĐẦU Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn. Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt là đái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học. Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2-DE và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44]. Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác.... Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể. Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8]. 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9]. Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng. /   Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30]   Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người. Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10]. IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10%. Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), (2-microglobulin ... thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan ((-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3]. Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán. 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau. Dựa theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh các nhóm sau [4]: Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus,…). Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông (AT III, protein C, protein S...) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể. Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm. Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất. Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận chuyển các protein cần thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô. Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme. 1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch, các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai. Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu của Anderson (2002) [9]. 1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó. Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2]. Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1). Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua. Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư [11, 43] Tên bệnh  Protein  Nồng độ     Bình thường  Bị bệnh   Ung thư trực tràng, ống tiêu hoá  CEA (Carcinoembryonine antigen)  3-5 ng/ml  10-20 ng/ml   Ung thư gan  AFP (α-fetoprotein)  3-5 ng/ml  10-100(g/ml   Ung thư tế bào nuôi  HCG (Human Chrionic Gonandotrophin)  5 IU/ml  1 triệu IU/ml   Ung thư vú  CA15-3  ---  Tăng cao   Ung thư tuyến tiền liệt  PAP (Prostatic acid phosphatase)  0-0.2 ng/ml  Tăng cao   Ung thư dòng lympho  β2-M (beta2-Microglobulin)  3.4 ng/ml  Tăng cao   Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [9]. Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [6]. Năm 2004, Chan và cộng sự bằng phương pháp điện di đẳng điện, sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ đã phát hiện được 1444 protein [13] và gần đây nhất năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO (Human Proteome Organization), con số này đã là 3020. Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai. 1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh là một trong những đối tượng nghiên cứu mới rất hấp dẫn trong nghiên cứu về huyết thanh. Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác và đầy đủ cho các protein loại này. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh được xem như là tập hợp các protein có khả năng chịu được nhiệt độ, vẫn giữ được hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98oC trong 10 phút theo phương pháp của Goufman và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ [22]. Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein truyền thống. Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein khác ở người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần. Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh. Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của chúng. Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến