Khóa luận Phát hiện virus bệnh dịch tả heo dựa trên đoạn gen ns5b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN KS. VƢƠNG HỒ VŨ KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Trước tiên con xin gởi ngàn lời cảm ơn đến ba mẹ kính yêu, ba mẹ đã luôn hy sinh để dành những gì tốt đẹp nhất cho con. Con xin cảm ơn tất cả người thân đã luôn yêu thương, quan tâm và luôn cổ vũ cho con học tập. Em xin chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt 4 năm học.  Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân và thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Hồ Vũ, anh Lương Quý Phương đã luôn chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập. Em xin gởi lời cảm ơn đến:  Thầy Phát, anh Út, chị Hưng, chị Trang, cùng với các anh chị ở Trung tâm đã luôn giúp đỡ, động viên em trong những lúc khó khăn.  Các bạn lớp CNSH K29 thân yêu đã luôn cùng tôi chia xẻ, cổ vũ và giúp đỡ nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN Ngô Thị Thu Ngân, Đại học Nông Lâm TP. Hồ chí Minh, tháng 9/2007, “PHÁT HIỆN VIRUS DTH DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Thị Dân KS. Vương Hồ Vũ KS. Lương Quý Phương Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08 năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá sinh trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH ngày càng được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH. Do đó, việc phát hiện virus DTH bằng phương pháp RT-PCR khuếch đại đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vào công tác chuẩn đoán bệnh và có thể được sử dụng để hình thành dữ liệu di truyền đánh dấu dịch tễ virus. Kết quả đạt được như sau: 1. Xác định được quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách. Nồng độ LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh sạch và chất lượng sản phẩm khuếch đại cao. 2. Đưa ra được quy trình RT-PCR một bước phát hiện gen NS5B của virus DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản phẩm khuếch đại không thay đổi. 3. Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tính cao. 4. Kết hợp được những đặc điểm bệnh tích thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH với nhau thông qua kết quả chẩn đoán RT-PCR dương tính. v SUMMARY Ngô Thị Thu Ngân, Department of Biotechnology, Nong Lam University, HCMC. September, 2007. The title of thesis: “DETECTION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENE”. Thesis were carried out from 01/03/07 to 01/08/07 at Biochemical Analysis and Experimental Center, Nong Lam University. One of the genes of CSFV genome is NS5B gene, which is widely used for research on CSFV isolation and genetic typing. Therefore, CSFV detecting based on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic sequence data to be used for epidemiological tracing of virus. Results obtained from the study: (1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample. At LiCl 2,5 M concentration, we collected higher pure RNA precipitate which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product. (2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with Taq concentration decreased from 2,5 UI down 2 UI, but RT-PCR product quality was not different. (3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT- PCR diagnostic. (4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive RT-PCR diagnostic result. vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa .............................................................................................................................. i Trang tựa ................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ................................................................................................................. iii Tóm tắt khóa luận ..................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................... v Mục lục ..................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii Danh sách các bảng .................................................................................................. ix Danh sách các hình và biểu đồ ................................................................................... x Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ........................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ........................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. Bệnh DTH .......................................................................................................... 3 2.2. Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh DTH ........................................................ 5 2.2.1. DTH điển hình.................................................................................................. 5 2.2.2. DTH không điển hình ...................................................................................... 6 2.3. Cấu trúc bộ gen virus DTH ................................................................................ 6 2.4. Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm .................................. 9 2.5. Sơ lược các nghiên cứu liên quan .................................................................... 15 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................. 17 3.1. Thời gian và địa điểm ...................................................................................... 17 3.1.1. Thời gian ........................................................................................................ 17 vii 3.1.2. Địa điểm ......................................................................................................... 17 3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 17 3.3. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 17 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 17 3.3.2. Hóa chất ......................................................................................................... 17 3.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 19 3.5. Phương pháp tiến hành ..................................................................................... 21 3.5.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm ............................................................................... 21 3.5.2. Ly trích RNA tổng số ..................................................................................... 21 3.5.3. Phản ứng RT-PCR .......................................................................................... 24 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27 4.1. Kết tủa RNA ở các nồng độ LiCl khác nhau ................................................... 27 4.2. Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng. ............................................................ 28 4.3. So sánh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR .......................................... 30 4.4. Mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích .............................. 32 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 34 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 34 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 35 Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................................... 35 Tài liệu tiếng Anh ..................................................................................................... 36 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 38 viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BDV : Border disease virus BVDV : Bovine viral diarrhoea virus cDNA : Complementary deoxyribonucleotide acid ctv : cộng tác viên DEPC : Diethyl pyrocarbonate DTH : Dịch tả heo EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate IRF-3 : IFN regulatory factor 3 IFN : Interferon M-MLV : Moloney murine leukemia virus MOPS : [N-morpholino] propanesulfonic acid 3’NTR : 3’ nontranslated NSP : Nonstructural protein PBS : Phosphate buffered saline OD : Optical density OIE : Office International des Epizooties RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcriptase – polymerase chain reaction SP : Structural protein Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet UI : Unit ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Thành phần phản ứng RT-PCR .............................................................. 25 Bảng 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl ................................. 27 Bảng 4. 2: Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq. ........................................................ 29 Bảng 4. 3: Tỉ số OD của ELISA và kết quả RT-PCR .............................................. 30 Bảng 4. 4: So sánh các mức OD của ELISA và RT-PCR ........................................ 31 Bảng 4. 5: Đặc điểm bệnh tích các mẫu RT-PCR dương tính và âm tính ............... 32 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus ........................................................................ 7 Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR .................................................................................. 12 Hình 4. 1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu kết tủa ở các nồng độ LiCl........................ 28 Hình 4. 2: Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq ...................................................... 29 Hình 4. 3: Kết quả sản phẩm RT-PCR các mẫu bệnh phẩm . .................................. 33 Biểu đồ 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl. ............................ 27 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả heo (DTH) là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó (Nguyễn Tiến Dũng, 1999) DTH là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có tính kháng nguyên chung với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và virus bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus). Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống. Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam. Để phân biệt chính xác virus gây bệnh DTH với những virus cùng chi Pestivirus như BVDV, BDV…, kĩ thuật RT-PCR trở nên hữu ích dựa trên các đoạn gen như E2 (Wirz, 1993; Harding, 1994; Rugg Li, 1996; Knepp, 2003; Risatt, 2002, 2004; Pereda, 2005). Paton và cộng sự (2000) phân tích ba đoạn gen (E2, 5’NTR, 2 NS5B) trong việc phân biệt chủng virus DTH và tổng kết sự phân biệt chủng virus DTH ở nhiều nơi trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các chủng ở một số nước. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về virus DTH của các tác giả như Bùi Nghĩa Vượng và ctv (2003), Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv (2001), Kim Văn Phúc và ctv (2004), Nguyễn Thế Vinh và ctv (2004), Hồ Thu Hương và ctv (2004)… tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những virus phân lập được từ các ổ dịch. Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH sau này. 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục tiêu Xác định quy trình RT-PCR phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B. 1.2.2. Yêu cầu Xác định triệu chứng và bệnh tích của heo bệnh, thu nhận mẫu bệnh phẩm. Ly trích RNA tổng số. Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton và cộng sự (2000) để nhân vùng gen NS5B. So sánh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm. 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BỆNH DTH 2.1.1. Giới thiệu DTH là một bệnh quan trọng nằm trong danh sách loại A của OIE. Những bệnh thuộc trong danh sách A được định nghĩa như là những bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan rất nguy hiểm và nhanh chóng, bất chấp biên giới quốc gia, trở thành hậu quả nghiêm trọng đối với kinh tế xã hội và sức khoẻ cộng đồng, trở nên quan trọng chính trong việc kinh doanh thú và những sản phẩm từ chúng (OIE, 2001).  Tình hình nhiễm bệnh DTH trên thế giới DTH được mô tả đầu tiên vào năm 1833 ở Ohio – Hoa Kỳ. Những năm sau đó, một bệnh trên heo ở Châu Âu biết như là chứng sốt trên heo giống y hệt như bệnh mô tả ở Hoa Kỳ. Cuối thế kỷ 19, DTH phân tán khắp nơi trên thế giới. Với sự gia tăng hiểu biết về nguyên nhân và dịch tễ học bệnh DTH, nhiều quốc gia thành công trong việc tiệt trừ virus bằng cách đưa ra những biện pháp tương đối đơn giản như luật vận chuyển thú và sự ngăn cấm cho thú ăn thức ăn chưa xử lý như Đan Mạch (1933), Phần Lan (1956), Úc (1963), Canada (1964), Thụy Sỹ (1974) và Mỹ (1977). Năm 1997 đã in dấu đậm nét trong tâm trí các nhà dịch tễ học, virus học, những cán bộ thú y và những người hoạt động trong ngành chăn nuôi heo: bệnh DTH, một bệnh mà Liên hiệp châu Âu từng nghĩ là đã được thanh toán đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp (tính đến ngày 31/12/1997 có 424 ổ dịch tại Hà Lan). Năm nước khối EU (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ) trở thành nạn nhân của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ. 4 Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh. Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức, Slovakia. Vào cuối năm 2003, dịch xuất hiện tại Nhật, Albania và Slovakia. Hiện nay, bệnh đã được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi, Mexico, các nuớc Trung mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á và Đông Nam Á: Hàn quốc, Indonesia, Philippine, Thái Lan, Việt Nam.  Tình hình bệnh DTH tại Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh DTH được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm 1923- 1924. Từ đó, bệnh trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi heo nước ta. Năm 1949-1950, dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú Yên, Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng. Năm 1968-1969, dịch phát ra hơn 20 tỉnh miền Bắc, theo thống kê có 481 ổ dịch nổ ra. Theo báo cáo của Cục thú y (1986), tại các tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường bị bội nhiễm với bệnh phó thuơng hàn: An Giang, Long An (1984), Tiền Giang và Hậu Giang (1985). Năm 1985, tại Đồng Nai và TP. Hồ Chí Minh xuất hiện DTH bội nhiễm với bệnh tụ huyết trùng. Năm 2000, có 18106 trường hợp bệnh DTH được báo cáo tại Việt Nam. Hiện nay, bệnh DTH vẫn còn tồn tại ở các dạng bệnh không điển hình gây trở ngại cho việc chuẩn đoán. 2.1.2. Dạng bệnh DTH là một bệnh truyền nhiễm riêng của heo. Nguyên nhân gây ra bởi virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có quan hệ mật thiết với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (bovine viral diarrhoea-BVD) và virus gây bệnh biên giới ở cừu (Boder disease-BD). Bệnh DTH có thể xuất hiện ở nhiều dạng khác nhau. Tuy nhiên, người ta chia bệnh DTH ra làm 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng, 1999): 5  Dạng siêu cấp tính: xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, sốt cao kết hợp với trạng thái thương hàn. Heo bệnh tử vong trong vòng 24 đến 48 giờ, chưa kịp xuất hiện triệu chứng trên da nên gọi là DTH trắng.  Dạng cấp tính: gây sốt cao từ 41 - 420C, heo bệnh biểu hiện mệt điển hình như heo con nằm chất đống. Sau 24 - 48 giờ mắt sưng húp và viêm kết mạc với các triệu chứng ngoài da (như vết chàm tím, xuất huyết, tụ huyết màu đỏ tại các vùng da mỏng, tai, chân, bụng, bao dương vật…), viêm dạ dày ruột (tiêu chảy, nôn mửa…), triệu chứng hô hấp (ho, tụ huyết phổi) và có thể xuất hiện triệu chứng thần kinh (loạng choạng, liệt, liệt nhẹ các chi sau…), tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngày sau khi phát bệnh.  Dạng á cấp tính hoặc mãn tính diễn ra trong 3 giai đoạn: Giai đoạn đầu: kéo dài 10 - 15 ngày, toàn bộ đàn heo phát bệnh, các triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tính nhưng ở mức độ nhẹ. Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm. Giai đoạn ba: xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phát bệnh toàn thân với các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu hoá hoặc cả hai (viêm phổi và ruột thông thường do Salmonella). Heo bệnh gầy mòn và tử vong trong vòng 1 đến 3 tháng.  Dạng không điển hình: biểu hiện dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động, chết yểu…), chậm lớn, chết rải rác. Dưới