Khóa luận phuơng pháp ly trích, thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourti sauvage

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC W X PHẠM THỊ ANH PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH,THU NHẬN VÀ LÀM GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG MỠ CÁ BASA PANGASIUS BOCOURTI SAUVAGE KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC ĐỘNG VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2006 2 Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Kim Phi Phụng, người cô đã cho em những ý tưởng khoa học, đã chỉ dạy, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện để em có thể làm việc tại phòng thực tập hóa hữu cơ. Cô đã truyền đạt kiến thức cũng như các phương pháp cần thiết để xử lý một vấn đề khoa học. Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Phan Kim Ngọc. Thầy không những đã dìu dắt em suốt bốn năm qua, động viên trong những lúc em khó khăn mà còn cho em niềm đam mê và nhiệt huyết khoa học. Em cũng xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Sinh học người và động vật. Thầy cô đã cho em những kiến thức làm hành trang trong cuộc sống. Cuối cùng, cảm ơn các bạn, các anh làm việc trong phòng thực tập Hóa hữu cơ, anh Thiện làm việc tại Viện Khoa Học và Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ em giải quyết các vấn đề phát sinh trong suốt quá trình hoàn thành bài luận văn này. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 7 năm 2006 Phạm Thị Anh 3 MỤC LỤC Lời mở đầu ..................................................................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO.............................................................................................................2 1.1.1. Lipid - Chất béo ..............................................................................................................................2 1.1.1.1. Định nghĩa .....................................................................................................................................2 1.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................................................2 1.1.1.3. Vai trò của lipid .............................................................................................................................3 1.1.1.4. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................3 1.1.2. Acid béo ............................................................................................................................................5 1.1.2.1. Công thức cấu tạo .......................................................................................................................... 5 1.1.2.2. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................5 1.1.2.3. Phân loại ........................................................................................................................................7 1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo ..............................................................................................................8 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học .............................................................................................12 1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic ........................................................................................12 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học ..........................................................................................................................12 1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể ...............................................................................................13 a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh ..............................................................................................13 b) Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào..............................................................................................13 c) Tác dụng đối với não .............................................................................................................................13 d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương ........................................................14 e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch .....................................................................................................14 f) Tác dụng đối với sự viêm .......................................................................................................................15 g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp ..........................................................................................................15 h) DHA và bệnh ung thư ............................................................................................................................16 i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn .....................................................................................................16 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA ..........................................................................16 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA........................................................................................18 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử ...........................................................18 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng .............................................................................................19 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................19 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn .....................................................................................................21 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc ......................................21 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................22 1.3.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................22 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid.....................................................................................................................22 4 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ ....................................................................................................................23 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym.................................................................................................................24 1.3.1.4. Xúc tác zeolit ................................................................................................................................25 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA ....................................................................................................26 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................26 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê .....................................................................................................................27 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................29 1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM.....................................................................30 1.4.1. Phân loại .........................................................................................................................................30 1.4.2. Đặc điểm cá basa............................................................................................................................31 1.4.3. Những sản phẩm từ mỡ cá basa ...................................................................................................31 1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa ................................................................................................32 1.4.3.2. Tinh luyện mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm..........................................................................34 PHẦN II: THỰC NGHIỆM 2.1. DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU ........................................................................................................36 2.1.1. Dụng cụ...........................................................................................................................................36 2.1.2. Nguyên liệu .....................................................................................................................................36 2.2. PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................................................37 2.2.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................37 2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................38 2.2.3. Phương pháp tạo phức giữa urê và các ester béo .......................................................................41 PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả phản ứng transester hóa ................................................................................................43 3.1.1.. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol methanol/mol dầu cá ................................................................43 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa .................................................................................................................................................44 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác ......................................................................................................45 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác ....................................................................................46 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng....................................................................................47 3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo với urê ........................................................................49 PHẦN IV: KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................................................54 4.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 5 LỜI MỞ ĐẦU Từ nhiều thập kỷ nay, vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là vấn đề chăm sóc trẻ em - nguồn nhân lực tương lai của đất nước. Hiện nay, cùng với những bước chuyển mình mạnh mẽ của thế giới thì các căn bệnh thời đại cũng có chiều hướng gia tăng. Chính vì vậy mà các sản phẩm trên thị trường đang được các nhà khoa học ra sức nghiên cứu để bổ sung thêm các thành phần quý, có tác dụng làm suy giảm và ngăn ngừa bệnh tật, đồng thời còn có ích cho việc phát triển trí não và tư duy của trẻ. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy nguồn acid béo bất bão hòa trong mỡ cá rất dồi dào trong đó có DHA, và ở Việt Nam đã được tìm thấy trong các loại cá da trơn hay còn được gọi là catfish như cá ba sa, cá tra… là các loại cá có nhiều mỡ được nuôi khá phổ biến ớ đồng bằng sông Cửu Long. Đặc biệt đối với cá basa, đây là một nguồn DHA khá triển vọng, có thể thu được một lượng lớn mỡ cá phế thải từ các nhà máy chế biến thủy hải sản xuất khẩu. Việc cần thiết là phải tìm ra một phương pháp thu nhận DHA từ mỡ cá sao cho có hiệu quả, tiết kiệm nhất, phù hợp với điều kiện kinh tế trong nước, đặc biệt là sản xuất ra được DHA chi phí thấp và giảm bớt nhập khẩu từ nước ngoài. Mặt khác, có nhiều công trình nghiên cứu phản ứng transester hóa mỡ cá basa thành nhiên liệu diesel sinh học, thay thế diesel truyền thống, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Từ những thực tế trên, em chọn cá basa làm nguyên liệu để tìm hiểu và ly trích DHA, đồng thời sử dụng phương pháp transester hóa với hy vọng có thể tận dụng được nguồn mỡ cá basa thừa trong nước để vừa ly trích được thành phần quý DHA vừa tạo ra được nguồn năng lượng sạch cho tương lai. Từ đó góp phần cải thiện chế độ dinh dưỡng cho người Việt Nam, đặc biệt là thế hệ trẻ. 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO 1.1.1. Lipid - Chất béo 1.1.1.1. Định nghĩa [18] Chất béo là một nhóm gồm nhiều hợp chất hóa học khác nhau. Triacylglycerol còn gọi là triglycerid hay glycerid hoặc mỡ trung tính. Là một este của glycerol và acid béo, được cấu tạo bởi ba nguyên tố C, H và O. Công thức tổng quát: R1, R2, R3: là các gốc của acid béo Lipid có đặc tính chung là không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, benzen, ether. Lipid gồm các acid béo, glycerid, glycerol, phospholipid, sterol. 1.1.1.2. Phân loại [8] a. Dựa vào phản ứng xà phòng hóa CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O 6 Lipid xà phòng hóa được. Nhóm này gồm các glycerid, glycerophospholipid và sáp nghĩa là những lipid mà trong phân tử có chứa este của acid béo cao phân tử. Lipid không xà phòng hóa được. Tức là những lipid trong phân tử không chứa chức este, nhóm này gồm các hydrocarbon, các chất màu và các sterol. b. Dựa vào độ hòa tan Lipid của acid béo (có từ bốn carbon trở lên) với một rượu. Nhóm này gồm: glycerolipid (este của glycerol), sphingolipid (amid của sphingozin), cerid (este của rượu cao phân tử), sterid (este của sterol), etoliteste tương hỗ của hợp chất đa chức acid rượu). Lipoid: Là những chất có độ hòa tan giống lipid. Nhóm này bao gồm: Các carotenoid và quinon, sterol tự do, các hydrocarbon. c. Dựa vào thành phần cấu tạo Lipid đơn giản: Là este của rượu và acid béo, thuộc nhóm này có: triacylglycerin, sáp (cerid), sterid. Lipid phức tạp: Trong phân tử của chúng ngoài acid béo và rượu còn có thành phần khác như acid phosphoric; bazơ nitơ; đường. 1.1.1.3. Vai trò của lipid [18] ™ Là thành phần cấu trúc màng sinh học (phospholipid, glycolipid). ™ Là cofactor của một số enzym. ™ Là các hormone và chất vận chuyển thông tin nội bào. ™ Là nguồn năng lượng dự trữ quan trọng cung cấp năng lượng cho cơ thể. Nếu oxi hóa hoàn toàn 1 g mỡ sẽ giải phóng 9 kcal lớn gấp 2 lần năng lượng thu được khi oxi hóa 1 g protein hoặc glucose. ™ Ngoài ra còn: giảm nhẹ chấn động cơ học đối với cơ thể (động vật chạy nhảy nhiều ở bàn chân có lớp đệm), vai trò trong sự vận chuyển hấp thu các chất hòa tan trong nó (hấp thu vitamin tan trong chất béo), lớp mỡ dưới da còn có vai trò cách nhiệt tốt giữ thân nhiệt ổn định nên có ý nghĩa đặc biệt đối với động vật ngủ đông ở các xứ lạnh. 1.1.1.4. Tính chất vật lý [18] ™ Chất béo có tỷ trọng thấp hơn nước (0,86 – 0,97). ™ Chất béo không tan trong nước, khi trộn với nước sẽ tạo thành hai lớp: nước ở dưới và chất béo ở trên, đầu COO- tiếp xúc với nước, đuôi kị nước nằm ở phía trên. Dưới tác động của các chất gây nhũ tương hóa như xà phòng (muối Na+ hay K+ của acid béo bậc cao) hoặc acid mật hay muối mật (do gan tiết ra), chất béo bị chia nhỏ trông như dạng sữa gọi là dạng nhũ tương bền. Nhờ vậy, xà phòng là chất tẩy rửa dầu mỡ sau các dung môi hữu cơ. Ngoài ra, điều đó cũng giải thích các bệnh nhân bị bệnh gan phải hạn chế thức ăn chứa chất dầu mỡ, mỡ, vì ở các cơ thể này, dầu mỡ trong thức ăn không được nhũ tương hóa, do đó lipase phân giải chậm. Lipid bao gồm các acid béo, các triglycerid, glycerol, các phospholipid và các sterol, trong đó acid béo là thành phần chính quan trọng nhất. ™ Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng, chiều dài mạch carbon và số lượng liên kết đôi trong phân tử. Ví dụ về điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid như bảng 1. 7 Bảng 1: Điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid Acid béo Điểm nóng chảy (oC) Triacylglycerol Điểm nóng chảy (oC) Palmitat 63,1 Tripalmitin ≈ 80 Stearat 69,6 Tristearin ≈ 80 Oleat 13,4 Triolein 0 Mỡ động vật chứa nhiều acid béo no, trong nhiệt độ bình thường ở trạng thái rắn, nhất là mỡ bò, mỡ cừu. Dầu thực vật cũng tùy theo tỷ lệ giữa acid béo no và không no, có điểm nóng chảy khác nhau. Ví dụ dầu ca cao chứa 35% palmitat và 40% stearat có điểm nóng chảy là 30 - 34oC. Ngược lại, dầu hướng dương chứa 85% acid béo không không no là oleat và linoleat, có điểm nóng chảy rất thấp: -21oC. Vì vậy, dầu thực vật luôn ở dạng lỏng. Nguyên nhân của trạng thái rắn hay lỏng của glycerid được giải thích là vì acid béo no, gồm một đầu phân cực (COO-) và đuôi kị nước (khung carbon của mạch) tạo nên cấu trúc ổn định và chặt, không bị phá vỡ. Acid béo không no có khung carbon bị gấp khúc, tạo sự sắp xếp lỏng lẻo dễ bị phá vỡ, do đó ở nhiệt độ bình thường chúng có trạng thái lỏng. 1.1.2. Acid béo 1.1.2.1. Công thức cấu tạo[18] Acid béo là thành chính của hầu hết các lipid. Cả lipid trong cơ thể lẫn thực phẩm. Công thức tổng quát: CH3 ─ (CH2)n ─COOH Số nguyên tử carbon trong acid béo thường là chẵn (14 - 22C). Các acid béo thường gặp có số carbon từ 16 - 18. Số thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon của acid béo được tính từ nguyên tử carbon của nhóm carboxyl. H3Cω (CH2)n Cβ Cα 3 2 C OH O 1 Ký hiệu: α, β, γ, ω,….để chỉ thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch. Về cơ bản acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên tử hydrogen. Ở một đầu của phân tử được xác định là đầu alpha, gắn với một nhóm carboxyl (−COOH). Một đầu còn lại của mạch là đầu cuối (omega), là nhóm methyl (−CH3). (Trong bảng chữ cái Hy Lạp α là ký tự đầu tiên và ω là ký tự cuối). 1.1.2.2. Tính chất vật lý [18], [8] Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại, các phân tử acid béo bất bão hòa có cấu tạo lệch, do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ hơn hơn các acid béo bão hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bất bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid béo bão hòa (đặc biệt các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Tóm lại, mỡ hoặc dầu được phân loại thành bão hòa, bất bão hòa đơn hay bất bão hòa đa dựa trên hàm lượng cao hoặc thấp của các loại acid béo hiện diện. Chiều dài của mạch carbon trong acid béo ảnh hưởng đến độ rắn chắc của triglycerid ở nhiệt độ thường. Cụ thể, các acid béo bão hòa chuỗi dài từ 12 carbon trở lên hiện diện ở những trạng thái rắn khác nhau ở nhiệt độ thường, trong 8 khi các acid béo bão hòa chuỗi vừa từ 6 đến 10 carbon (ví dụ dầu dừa) và chuỗi ngắn dưới 6 carbon hiện diện ở dạng lỏng ở nhiệt độ thường. Các triglycerid chứa các acid béo bất bão hòa đa và đơn cũng tồn tại ở dạng lỏng . Vị trí nối đôi C=C trong chuỗi carbon của các acid béo bất bão hòa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách 3 carbon so với đầu methyl (omega) của acid béo, nó là acid béo omega-3 (ω-3). Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách đầu methyl 6 carbon, nó là acid béo omega-6 (ω-6). Theo qui ước tương tự, một acid béo omega-9 (ω-9) có nối đôi đầu tiên cách đầu methyl của acid béo 9 carbon. Trong thực phẩm, acid α- linolenic (ALA, 18:3 n-3) là acid béo ω-3 chủ yếu; acid linoleic (18:2 n-6) là acid béo ω-6 chủ yếu; và acid oleic (18:1 n- 9) chủ yếu. Bảng 2: Cấu trúc hóa học của các acid béo bất bão hòa tiêu biểu thuộc các nhóm ω-3, ω-6, ω-9. Tên acid Ký hiệu Công thức hóa học α-linolenic 18:3 n-3 CH3CH2(CH=CH_CH2)3(CH2)6COOH Linoleic 18:2 n-6 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Oleic 18:1 n-9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (Ghi chú: