Khóa luận Sử dụng kỹ thuật rapd khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizotonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẲN LÚA Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh -2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẰN LÚA GVHD: Sinh viên thực hiện: ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh 8 - 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con bƣớc qua những khó khăn.  Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực tập tốt nghiệp. Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2007. Nguyễn Thị Minh Thƣ iv TÓM TẮT Nguyễn Thị Minh Thƣ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”. Bệnh khô vằn lúa gây ra bởi nấm R. solani đƣợc xem là bệnh gây ra nhiều thiệt hại rất nghiêm trọng trên lúa. Sự đa dạng di truyền cùng với phổ kí chủ rộng của nấm gây khó khăn cho việc lựa chọn các dòng kháng cũng nhƣ việc xây dựng các biện pháp phòng và trị nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm là một bƣớc cần thiết nhằm hiểu rõ hơn về di truyền của quần thể nấm và cung cấp thêm thông tin cho việc xây dựng phƣơng pháp phòng và trị nấm. 17 dòng phân lập nấm R. solani thu thập từ nhiều tỉnh khác nhau đƣợc li trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13. Phân tích dữ liệu phản ứng RAPD bằng phần mềm NTYSYSpc đã chia 17 dòng nấm thành 2 dòng lớn. Sơ đồ phân nhóm có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 53 – 89 % và cho thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R. solani. Thông tin của nghiên cứu này có thể dùng để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của các dòng nấm R. solani và làm cơ sở để xây dựng phƣơng pháp phòng và trị nấm một cách hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. v SUMMARY Nguyen Thi Minh Thu, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, 8/2007. “Use RAPD analysis study genetic diversity of Rhizoctonia solani population pathogenic sheath blight in rice”. Sheath blight caused by R. solani is an important disease on rice. This disease is cause of serious damage in rice crop. Chosing assistant plant culture and building strategy against this fungi is very difficult because of genetic diversity of R. solani isolates. So, study genetic diversity is the fisrt step to know about this fungi. Therefore, 17 R. solani isolates were recognized from several diffirent provinces were extracted total DNA and realize RAPD reaction with three primer OPL-05, OPL-08, OPM-13. Analysis RAPD data by NTSYSpc software was divided 17 isolates place into two group. Rate genetic similarity of these analysis isolate was a range from 53 to 89% . Information of study could enhance knowledge about genetic of R. solani isolates and to basis to build a method against fungi effect and safe for environment. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm tạ ................................................................................................................. iii Tóm tắt ...................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục lục ..................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... ix Danh sách các hình ..................................................................................................... x Danh sách các bảng ................................................................................................... xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài ................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu đề tài .............................................................................................. 2 1.3.Giới hạn của đề tài .............................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1.Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani ................................................................... 3 2.1.1.Đặc điểm hình thái........................................................................................ 3 2.1.2. Đặc điểm sinh lý .......................................................................................... 4 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................... 5 2.1.4. Phạm vi kí chủ của nấm Rhizoctonia solani................................................ 5 2.1.5. Sự phân nhóm của nấm Rhizoctonia solani ................................................ 6 2.2. Bệnh khô vằn hại lúa do nấm Rhizoctonia solani gây ra ..................................... 6 2.2.1. Triệu chứng bệnh ......................................................................................... 7 2.2.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh ........................................................ 7 vii 2.2.3. Phòng chống bệnh khô vằn ......................................................................... 8 2.3. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền .............. 9 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) ........... 9 2.3.2. Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) ............ 10 2.3.3. Microsatellite ............................................................................................. 11 2.3.4. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA) ....... 11 2.3.4.1. Giới thiệu kỹ thuật RAPD ................................................................... 11 2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD ................. 12 2.3.4.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD .................................................... 13 2.3.4.4. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD ..................................................... 13 2.3.4.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ............................................................. 13 2.3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD ..................................................... 14 2.4. Các kết quả nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani. ...... 14 2.4.1. Những nghiên cứu trong nƣớc.. ................................................................. 14 2.4.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngoài. .............................................................. 15 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 16 3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 16 3.2.1. Nguồn nấm ................................................................................................ 16 3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 16 3.2.2.1. Những hóa chất sử dụng để li trích DNA ............................................ 16 3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD .......................... 16 3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD ......................... 18 3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ........................... 18 3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong li trích ............................ 18 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong phản ứng RAPD ............ 18 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di .......................................... 18 3.3. Phƣơng pháp tiến hành....................................................................................... 19 3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani .................................................. 19 viii 3.3.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD ...................................................................... 19 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát số lƣợng chu kì phản ứng .............................. 20 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD ................................................................................................................. 21 3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD ....................................................................... 23 3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD ........................................................................... 23 3.3.5. Phân tích kết quả RAPD ............................................................................ 23 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 24 4.1. Kết quả li trích DNA tổng số của nấm R. solani ............................................... 24 4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD .............................................................................. 25 4.2.1. Lƣợng DNA mẫu ....................................................................................... 25 4.2.2. Khảo sát chu kì phản ứng .......................................................................... 26 4.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD .............. 26 4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani ..................................... 29 4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani ................ 32 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 37 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 37 5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 37 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 38 PHẦN 7: PHỤ LỤC .................................................................................................. 41 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified fragment length polymorphism PDA Potato dextrose agar R. solani Rhizoctonia solani RAPD Random amplification polymorphism DNA RFLP Retriction fragment length polymorphism SSR Simple sequense repeat VNTR Variable number tandem repeat x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bệnh khô vằn trên cây lúa ...................................................................... 6 Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani ......... 24 Hình 4.2. Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R. solani sau khi pha loãng ..................................................................................................................... 25 Hình 4.3.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPM-08 ở các số chu kì khác nhau của qui trình nhiệt .......................................................... 26 Hình 4.4.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau .............................................................. 27 Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ DNA mẫu và Taq khác nhau ............................................................ 28 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13 ..................................................................................................... 29 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-05 ...................................................................................................... 30 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-08 ...................................................................................................... 30 Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) của 17 dòng phân lập nấm R. solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPl-08 ........................... 32 . xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1.Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R.solani đƣợc dùng trong nghiên cứu .................................................................................................. 17 Bảng 3.2. Tên và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu .............................. 17 Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD ................................................... 20 Bảng 3.4. Thành phần hoá chất đƣợc sử dụng trong phản ứng RAPD ................ 20 Bảng 3.5. Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 1 ............................ 21 Bảng 3.6. Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 2 ............................ 22 Bảng 4.1. Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm R. solani ................................................................... 29 Bảng 4.2. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (%) giữa 17 dòng phân lập nấm R. solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 ........ 33 Bảng 7.1. Số liệu mã hoá của sản phẩm phản ứng RAPD trƣớc khi xử lí bằng phần mềm NTSYS ........................................................................................................ 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Rhizoctonia solani Kühn là loài nấm quan trọng nhất của nấm Rhizoctonia và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh khô vằn lúa. Hiện nay, nấm R. solani đang gây bệnh khô vằn lúa trên khắp lãnh thổ Việt Nam gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng. Nấm R. solani không chỉ gây bệnh trên cây lúa mà còn gây nhiều bệnh trên các cây trồng khác nhƣ đậu xanh, đậu nành, mía, khoai tây, lúa miến và trên một số loài cây ăn quả. Không những thế, R. solani còn kí sinh đƣợc trên cả các loài cỏ nhƣ cỏ chỉ, cỏ ống, cỏ linh lăng, cỏ lồng vực….. Phòng trừ bệnh này bằng biện pháp luân canh hiện nay không có hiệu quả do phổ kí chủ quá rộng của nấm R. solani. Bên cạnh đó, sự đa dạng di truyền của nấm gây khó khăn cho việc sàng lọc các giống kháng. Việc phòng trừ nấm bằng hoá chất thì cho hiệu quả khá cao, tuy nhiên, phƣơng pháp này lại gây hại cho môi trƣờng đồng thời cũng ảnh hƣởng xấu đến tính an toàn của sản phẩm lúa gạo. Để có thể kiểm soát bệnh khô vằn lúa do R. solani gây ra thì cần phải hiểu về cấu trúc quần thể của các dòng phân lập nấm R. solani. Bƣớc đầu tiên để có thể hiểu đƣợc cấu trúc quần thể là cần phải hiểu về sự đa dạng di truyền của R. solani bởi sự đa dạng di truyền phản ánh lịch sử tiến hoá và tiềm năng tiến hoá của quần thể. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của các loài nấm bệnh nói chung và R. solani nói riêng nhƣ RFLP, RAPD, AFLP…….Trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng, RAPD đƣợc xem là kỹ thuật có nhiều ƣu điểm do rẻ tiền, nhanh, nhạy, cần lƣợng mẫu ít và không cần biết trình tự DNA của loài cần nghiên cứu. Do những ƣu điểm đó nên RAPD đã đƣợc chọn để thực hiện đề tài này. Với mong muốn đƣợc hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani gây bệnh trên lúa, nhằm cung cấp thêm thông tin để xây 2 dựng biện pháp quản lí nấm một cách hữu hiệu, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa”. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa, cung cấp thông tin để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của nấm R. solani và làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng trừ nấm hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài Li trích DNA của các dòng phân lập nấm R. solani Tối ƣu hoá qui trình nhiệt và thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD. Dùng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của dòng nấm R. solani. 1.3. Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ đƣợc thực hiện với 3 primer ngẫu nhiên và 17 dòng nấm phân lập (isolate) R. solani. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani Nấm Rhizoctonia solani là một nhóm nấm lớn rất đa dạng và phức tạp. Giai đoạn vô tính, R. solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia steliria, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti (theo Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). Giai đoạn hữu tính nấm có tên là Thanatephorus cucumeris, thuộc họ Ceratobasidiaceae, bộ Ceratobasidiales, ngành Basidiomycota. R. solani thƣờng tồn lƣu dƣới dạng sợi nấm và hạch nấm trên tàn dƣ thực vật và trên đồng ruộng. Bào tử hữu tính hiếm khi gặp trên cây bệnh. Trƣớc đây, Pellicularia filamentosa và Corticium solani là tên đƣợc sử dụng cho loài nấm này. 2.1.1. Đặc điểm hình thái Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào, có đƣờng kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tƣơng đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất hay thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhƣng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đƣờng Hồng Dật, 1976). Đƣờng kính hạch nấm từ 1- 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dƣới nƣớc nhƣng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). 4 Sợi nấm của R. solani có nhiều nhân ( thông thƣờng từ 4 đến 8 nhân) trong một tế bào. Điều này khác biệt với các nấm Rhizoctonia khác có đặc tính của sợi nấm tƣơng tự