Khóa luận Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN VĂN NAM ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Khóa : 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr. NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms. NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại viện. Cô Nguyễn Lệ Hà, người đã tận tình hướng dẫn giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị cán bộ nghiên cứu của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi thực tập nghiên cứu đề tài tại trung tâm. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài. Các bạn thực tập cùng phòng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu đề tài. Con cảm ơn cha me, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành trang cho con bước vào đời. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:  PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.  Ths. Nguyễn Lệ Hà. Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease. Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris- HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... IV TÓM TẮT KHÓA LUẬN ....................................................................................... V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ IX DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................... X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ........................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME ............................................................. 3 2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme .............................................. 3 2.1.2. Định nghĩa về enzyme ............................................................................... 4 2.1.3. Cấu tạo phân tử ......................................................................................... 4 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại ............................................................... 6 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme .......................................... 6 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM ............................... 8 2.2.1. Giới thiệu về tôm ....................................................................................... 8 2.2.2. Khái quát protease .................................................................................. 10 2.2.2.1. Định nghĩa protease ......................................................................... 10 2.2.2.2. Protease của tôm .............................................................................. 11 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc .............. 12 a). Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................ 12 b). Nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................ 13 2.2.3. Ứng dụng của protease ........................................................................... 14 2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU ...................................................................................................................... 15 2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. ................................................................. 15 2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ............................................................... 16 2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel ................................................... 18 2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp ............................................................... 18 2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel .................................................................. 20 a). Chọn lựa gel ......................................................................................... 20 b). Chuẩn bị gel và bảo quản ..................................................................... 20 2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ............................................................... 20 a). Dựng cột lọc gel ................................................................................... 20 b). Chuẩn bị mẫu ....................................................................................... 21 2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel ...................................... 21 vii 2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel .............................................. 22 a). Ƣu điểm ................................................................................................ 22 b). Nhƣợc điểm ......................................................................................... 22 2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE ..... 22 2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME ..... 24 2.5.1. Phương pháp Biuret ................................................................................ 24 2.5.2. Phương pháp Lowry ................................................................................ 25 2.5.3. Phương pháp Bradford ........................................................................... 25 2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) .................................... 26 2.5.5. Phương pháp đo phổ ............................................................................... 26 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 27 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .......................................................................... 27 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU ............................. 27 3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 27 3.2.2. Hóa chất .................................................................................................. 28 3.2.3. Thiết bị .................................................................................................... 28 3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG .................................... 29 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 29 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú ....................... 29 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease .................................................................. 29 3.4.3. Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 30 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp ............................................................................................ 31 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC .......... 32 3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT ..... 33 a). Nhiệt độ ................................................................................................ 33 b). pH ......................................................................................................... 33 c). Nồng độ muối ăn .................................................................................. 34 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel..................................................... 35 3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .. 35 3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................... 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 36 4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME ................... 36 4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau ......... 36 4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 38 4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 39 4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 41 4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp ....................... 42 4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC ................... 44 viii 4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau ........................... 44 4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau............... 46 4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau ................................................................................................................... 47 4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân ................................... 49 4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT ......................................................................................... 51 4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 51 4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................................... 52 4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 53 4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL ........................ 55 4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE .............. 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 64 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 64 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1 Phụ lục chƣơng 3 .................................................................................................... 69 1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford .......................... 1 2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano ............................ 3 3. Phương pháp sắc ký lọc gel ............................................................................ 7 4. Điện di SDS-PAGE ......................................................................................... 9 a). Chuẩn bị hộp điện di .............................................................................. 9 b). Chuẩn bị mẫu protein ........................................................................... 10 c). Đƣa mẫu vào các giếng ........................................................................ 10 Phụ lục chƣơng 4 .................................................................................................... 80 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT NT: nội tạng. DC: dịch chiết. CPT: chế phẩm thô. TN: thí nghiệm. ĐC: đối chứng. dd: dung dịch. HT: hoạt tính. HTR: hoạt tính riêng. HL: hàm lƣợng. MW: molecular weight OD: optical density SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine UV: ultra viole x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme .. ................................................................................................................................... 24 Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu .................................................................................................. 42 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protease của CPT ....................................................................................................... 49 Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme protease sau sắc ký lọc gel ........................................................................................ 58 Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE .... 62 Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE ........... 62 xi DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình Trang Hình 2.1. Tôm sú ......................................................................................................... 9 Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease ....................................................................... 10 Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký .............................................................. 17 Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel ................................................................... 18 Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối ............................................................................ 21 Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. .................................................. 26 Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú ...................................................................... 27 Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu nội tạng ............................................................................................ 55 Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu đầu tôm ............................................................................................ 55 Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu nội tạng ...................................................................................... 56 Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu đầu tôm ..................................................................................... 56 Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng................................................................................. 57 Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu............................................................................... 57 Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng .......................... 60 Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu .................................. 60 Đồ Thị Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ............................................................................................ 36 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu /nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu tôm sú ........................................................................................ 37 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ..................................................................... 38 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 38 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .................................................................... 39 Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 40 xii Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng