Khóa luận Tuyển non dõng vô tính cao su (hevea brasiliensis muell. arg.) kháng bệnh rụng lá corynespora (corynespora leaf fall disease)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN VĂN CẢNH NGUYỄN NGỌC THANH TRANG ThS. PHAN THÀNH DŨNG TS. PHAN PHƢỚC HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phước Hiền đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Ban Giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi, KS. Nguyễn Ngọc Mai và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Các cô, chú, anh, chị tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè thân yêu của lớp DH03SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và giáo dục. Bố mẹ và anh chị luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2007 NGUYỄN NGỌC THANH TRANG iv TÓM TẮT NGUYỄN NGỌC THANH TRANG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. “TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease)”. Thực hiện từ 03/03/2007 đến 30/07/2007 tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phƣớc Hiền. Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá cao su (10 – 12 ngày tuổi) của một số dvt bị nhiễm CLFD và mẫu lá hoàn toàn sạch bệnh. Nội dung nghiên cứu: Đánh giá tính kháng CLFD trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo; Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su; Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. Kết quả đạt được: Đánh giá tính kháng: + Là phương pháp tin cậy. + 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng, 12/60 dvt nhiễm nặng, 22/60 dvt nhiễm trung bình và 11/60 dvt nhiễm nhẹ. Khảo sát hoạt tính POD: Dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau; Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh; Không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính mẫn cảm với CLFD của các dvt.  Khảo sát mật độ khí khổng: Dvt khác nhau có số lượng khí khổng khác nhau; Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều càng dễ bị nhiễm bệnh. v SUMMARY NGUYEN NGOC THANH TRANG, Nong Lam University. “SCREENING RUBBER CLONES (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) RESISTANT TO CORYNESPORA LEAF FALL DISEASE”. The research was carried out from 03/03/2007 to 30/07/2007 at the laboratoy of Crop Protection Division, Molecular biology laboratory, laboratory of Experiment’s Rubber Technology Center – Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV). Supervisors: PhD. Tran Van Canh, Msc. Phan Thanh Dung and PhD. Phan Phuoc Hien. Materials and Methods: + Corynespora disease rubber leaflets (10 – 12 days old) used for estimation of POD activity. + Free – diseased leaflets (10 – 12 days old) used for artificial inoculation with Corynespora cassiicola and estimation of the number of stomas. + 60 rubber clones were screened for resistance to Corynespora leaf fall disease using detached leaflets technique and droplets of spore suspension. Results: + Screening rubber clones resistant to CLFD using detached leaflets technique is a reliable method. + 100% clones investigated were infected to CLFD at various susceptible levels. Among 60 clones, 15 clones are very severely infected; 12 clones are severely infected; 22 clones are moderately infected and 11 clones are lightly infected. + POD activities and the number of stoma are different from various clones. Generally, the more susceptible clones are, the more the number of stoma they have. The more POD activities the clones have, the less they are susceptible to the disease. But there is no linear correllation found between POD activity or the number of stoma and the disease severity. vi MỤC LỤC TÊN MỤC TRANG LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. x DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ xi DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. xii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ ......................................................................................... xiii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ...................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ............................................................................................... 3 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 2.1. Sơ lược về cây cao su .................................................................................... 4 2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó ...................................................... 4 2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su .......................................................... 5 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola ........................................................................ 6 2.2.1. Phân loại học ............................................................................................ 6 2.2.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7 2.2.3. Đặc điểm sinh lý ...................................................................................... 7 2.2.4. Khả năng tồn tại ....................................................................................... 7 2.2.5. Khả năng phát tán .................................................................................... 8 2.2.6. Con đường xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh của nấm C. cassiicola ................................................................................. 8 vii 2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ............................... 9 2.3.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 9 2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su .............................. 10 2.3.2.1. Trên vườn ươm .............................................................................. 10 2.3.2.2. Trên vườn khai thác ....................................................................... 11 2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới ................................................................ 12 2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp tuyển non dvt ......... 13 2.4. Sơ lược về enzyme ...................................................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa ............................................................................................. 13 2.4.2. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 13 2.4.3. Cơ chế tác động ..................................................................................... 14 2.4.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme ................................ 14 2.4.5. Một số phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ............................ 14 2.4.6. Sơ lược về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật .............. 16 2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su ....................... 17 2.4.8. Peroxidase .............................................................................................. 17 2.4.8.1. Sơ lược về peroxidase .................................................................... 17 2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su ..................................... 18 2.5. Sơ lược về khí khổng ................................................................................... 18 2.5.1. Cấu tạo ................................................................................................... 18 2.5.2. Sự phân bố ............................................................................................. 19 2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật .................................................. 20 2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng ............................................ 20 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................ 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 21 3.2. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 21 viii 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu lá ........................................................................ 21 3.2.2. Phương pháp phân lập nấm C. cassiicola .............................................. 22 3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 22 3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm .......................................................................... 22 3.2.2.3. Nhân số lượng bào tử ..................................................................... 22 3.2.3. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo ................................................................. 23 3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ ........................................................................ 23 3.2.3.2. Phương pháp .................................................................................. 23 3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện .................................................... 25 3.2.4. Phương pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt ....... 25 3.2.4.1. Mục đích ........................................................................................ 25 3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất ......................................................... 25 3.2.4.3. Phương pháp .................................................................................. 25 3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 27 3.2.5. Phương pháp đếm số lượng khí khổng trên lá của một số dvt cao su ... 27 3.2.5.1. Mục đích ........................................................................................ 27 3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 27 3.2.5.3. Phương pháp .................................................................................. 27 3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 28 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 29 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê ........................................ 29 4.2. Kết quả phân lập .......................................................................................... 31 4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................................................................................. 32 4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng bệnh CFLD trên một số dvt cao su ............................................................. 36 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .. 36 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt ................................... 38 ix 4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su ..................................................... 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 43 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 43 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 x DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo Vệ Thực Vật C. cassiicola Corynespora cassiicola CLFD Corynespora Leaf Fall Disease CRD Completely Randomized Design Dvt Dòng vô tính H. brasiliensis Hevea brasiliensis NT Nghiệm thức PDA Potato Dextrose Agar POD Peroxidase PR proteins Pathogenesis Related Proteins PSA Potato Sucrose Agar UV Ultra Violet VNCCSVN Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam xi DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................... 24 Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vườn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê ................ 31 Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su ................................. 33 Bảng 4.3: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ mẹ .............................................................................................................................. 34 Bảng 4.4: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ bố ............................................................................................................................... 34 Bảng 4.5: Bảng kết quả đo hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .......... 37 Bảng 4.6: Bảng kết quả đo POD trên mẫu lá bệnh ................................................... 38 Bảng 4.7: Bảng kết quả đếm số lượng khí khổng ..................................................... 41 xii DANH SÁCH HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng ..................................................................................... 19 Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng........................................................... 20 Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên ........................................... 24 Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non ...................... 30 Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già ..................... 30 Hình 4.2a: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo PSA ................................. 32 Hình 4.4: Dvt LH 94/612 sau 5, 7 và 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD.......... Error! Bookmark not defined. Hình 4.5: Khí khổng của một số dvt cao su .............................................................. 41 xiii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Hoạt tính POD trên mẫu đối chứng và mẫu bệnh của 12 dvt cao su ... 38 Biểu đồ 4.2: Mối tương quan giữa hoạt tính POD và mức nhiễm bệnh CLFD ........ 39 Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ giữa số lượng khí khổng và tính mẫn cảm với CLFD của 12 dvt cao su .............................................................................................................. 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm chính từ chúng là mủ. Mủ cao su đứng thứ 3 trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta sau lúa và cà phê, đóng góp không nhỏ vào nền kinh tế quốc gia. Cũng như nhiều loại cây trồng khác, cây cao su bị nhiều loại mầm bệnh tấn công, một trong những loại bệnh hại trên cây cao su được quan tâm là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei. gây ra. Bệnh xuất hiện đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949, nhưng đến năm 1985 mới bùng phát thành đại dịch. Cho đến nay bệnh càng trở nên nghiêm trọng cả về mức độ, phạm vi gây bệnh và số lượng các dòng vô tính (dvt) cao su cao sản nhiễm bệnh ngàng càng tăng. Tuy nhiên, khi xây dựng chiến lược quản lý CLFD thì lại gặp những khó khăn do nấm C. cassiicola có khả năng gây bệnh quanh năm trên mọi tuổi lá và mọi giai đoạn sinh trưởng của cây; ngoài ra, nó còn gây bệnh trên cả cuống lá và chồi. Tác hại của bệnh rất lớn, cây thực sinh trong giai đoạn vườn ươm bị nhiễm bệnh làm cây chậm phát triển và không đạt được đường kính gốc ghép theo đúng thời điểm (Jacob, 2006). Trên vườn khai thác, trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể làm cho cây bị chết và giảm sản lượng mủ từ 20 – 25%. (Nguồn: Report/Report2000.htm#Corynespora). Ở nước ta, CLFD được ghi nhận vào năm 1999, Cho đến nay bệnh chưa bùng phát thành đại dịch nhưng mức độ và phạm vi tác hại của bệnh đã gia tăng đáng kể. Nếu không có biện pháp quản lý và ngăn chặn kịp thời thì bệnh có thể bùng phát thành đại dịch sẽ gây thiệt lớn về kinh tế. Hiện nay, trên thế giới đã sử dụng nhiều chiến lược quản lý CLFD như kiểm soát về mặt di truyền, hoá học, sinh học... Phương pháp hóa học tương đối tốn kém 2 hiệu quả lại không cao. Những năm gần đây biện pháp kiểm soát sinh học đang được nghiên cứu ứng dụng ở một số nước trồng cao su nhằm hạn chế những tác hại của biện pháp hóa học. Phương pháp tuyển chọn các dvt có khả năng kháng hoặc ít mẫn cảm với bệnh đang được sử dụng ở môṭ số nước trồng ca