Khóa luận Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16s rrna trên dna ty thể trong định danh cá bột thuộc họ pangasiidae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000******** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN KIỀU DỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000******** ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO NGUYỄN KIỀU DỢI ThS. NGUYỄN VIẾT DŨNG KS. NGUYỄN NGUYỄN DU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn Chƣơng Trình Thuỷ Sản Ủy Hội Sông MêKông đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này. Tôi đặc biệt cảm ơn anh Nguyễn Nguyễn Du, anh Nguyễn Viết Dũng đã tận tâm, nhiệt tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn anh Lâm Ngọc Châu, anh Nguyễn Văn Phụng phòng Nguồn Lợi Thủy Sản cùng chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hòan thành tốt đề tài. Sau cùng tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học k29 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện NGUYỄN KIỀU DỢI iv ABSTRACT Morphological study plays important role in post-larvae fish taxonomy of the family Pangasiidae that contributes significantly to economy of the MeKong River Basin. However, this method bring limit true results. therefore we analysised the level of genetic diversity (A partial region of mitochondrial 16S rRNA gene, approximately 568 base pairs) of three catfish species to support morphological method. In this study, 976 specimens, originating from Mekong and Bassac River (from june 2006 to september 2006) were analysed morphologically. The result, the family Pangasiidae rate of 36,56% per in total specimens in 2006; three species (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) rate of 33,63% per in total Pangasiidae specimens and individual rate of 11,36% per in total number Pangasiidae. All Pangasiidae specimens of 2006 don’t analysised DNA because DNA was broke by formol. 26 individuals (size from 15 mm to 30 mm) from 64 specimens (6/2007) were add from three species: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. All specimens were sequenced and compared with standard sequence in genbank. This result, Sequences of 8/9 samples P. hypophthalmus similary with P. hypophthalmus (DQ334282, DQ334385, DQ334287). The exception of H1 sample, with one mutation at site nucleotide 26 to GenBank (DQ334282 – DQ334289); Sequences of 9 samples P. macronema similary from 99% to 100% sequences of P. macronema to GenBank (DQ334314); Sequences of 8 samples P. larnaudii similary 100% sequences of three haplotypes P. larnaudii (DQ334303, DQ334312, DQ334313). All in all, findings from this study demonstrated that morphological method correspond with three species P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. v TÓM TẮT Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho độ chính xác nhất định. Vì vậy chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ 568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để hỗ trợ phƣơng pháp định danh hình thái. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Kết quả họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006; 3 loài phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc nhƣng số lƣợng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasidae. Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích đƣợc DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến tháng 30/6/2007 đƣợc bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thƣớc khác nhau (từ 15 mm – 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:  Trình tự 8/9 mẫu loài P. hypophthalmus tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287). Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene.  Trình tự 9 mẫu phân tích loài P. macronema giống từ 99% - 100% trình tự P. macronema trên ngân hàng gene (DQ334314).  Trình tự 8 mẫu loài P. larnaudii tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313). Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định đƣợc khoá phân loại hình thái đối với các loài mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG Lời cảm tạ .................................................................................................................. III Abstract .................................................................................................................... IV Tóm tắt ....................................................................................................................... V Mục lục ..................................................................................................................... VI Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ IX Danh sách các hình ..................................................................................................... X Danh sách các bảng và biểu đồ ................................................................................ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 1.3. Nội dung đề tài ................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá ..................................................... 3 2.1.1. Nghiên cứu thế giới ....................................................................................... 3 2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc .................................................................................. 4 2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................ 5 2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá .................. 8 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ......... 8 2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ................ 8 2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .......... 8 2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) ................................................................ 9 vii 2.3.5. Phƣơng pháp PCR.................................................................................... 11 2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động ........................ 12 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................... 13 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................................... 13 3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 13 3.2.1. Mẫu cá...................................................................................................... 13 3.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 13 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 14 3.3. Phƣơng pháp ................................................................................................... 15 3.3.1. Phƣơng pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột .............................. 15 3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform...................... 16 3.3.3. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA ............................ 16 3.3.4. Phƣơng pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose ............................ 17 3.3.5. Phƣơng pháp giải trình tự ........................................................................ 18 3.3.6. Phƣơng pháp so sánh các trình tự ............................................................ 18 3.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 18 3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................................... 18 3.4.1.1. Giai đoạn định tính ............................................................................ 18 3.4.1.2. Giai đoạn định lƣợng ........................................................................ 20 3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ......... 21 3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA .............................. 22 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23 4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................... 23 4.1.1. Kết quả hình thái phân loại ...................................................................... 23 4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính ...................................................................... 25 viii 4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006 ........................................................................................................ 25 4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae .................................................................................................... 27 4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng .................................................................. 29 4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác .......... 29 4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae ......................................................................................... 31 4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ............... 33 4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA ..................................... 34 4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA ................................................. 34 4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá ............ 38 4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema ...................................... 38 4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus ................................ 40 4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. ......................................... 42 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 44 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 44 5.2. Tồn tại ............................................................................................................. 45 5.3. Đề xuất ............................................................................................................ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 46 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ DNA Deoxyribonucleic acid mtDNA Mitochondrial DNA rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid S Svedberg – đơn vị đo lƣờng vận tốc lắng PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction Fragment Length Lolymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Taq Thermus aquaticus UI Unit UV Ultra violet P. hypophthalmus Pangasianodon hypophthalmus P. larnaudii Pangasius larnaudii P. macronema Pangasius macronema ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long Ctv Cộng tác viên x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm ........................... 6 Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 16 mm. .............................................. 6 Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm. .......................................... 7 Hình 2.4: H.2.5a. Cấu tạo tổng quát của ty thể. .......................................................... 9 Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan ..................................................... 12 Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm ........................ 33 Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm ............................................. 34 Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm ......................................... 34 Hình 4.4. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005 ............................................................................................. 35 Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại diện ...................................................................................................................... 38 Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. macronema ....................................................................................................... 39 Hình 4.7: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. hypophthalmus .......................................................................................................... 41 Hình 4.8: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P. larnaudii ................................................................................................................... 43 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart Termvidchakorn,2003) ................................................................................................ 7 Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích .............................................................. 37 Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 ............... 25 Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ....... 25 Biểu đồ 4.3. Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc ........................................................................................................................... 27 Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu Pangasiidae .............................................................................................................. 27 Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác ......... 29 Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae ............................................................................................................... 29 Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae ............................................................................................................... 31 Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae ............................................................................................................... 31 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đồng Bằng Sông Cửu Long nƣớc ta thuộc khu vực hạ lƣu sông Mekong, vốn có nguồn tài nguyên thủy sản phong phú. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng và sự thay đổi thành phần các loài cá sẽ giúp ích cho việc quản lý và phát triển chiến lƣợc cho nghề nuôi trồng thủy sản tại khu vực này. Phƣơng pháp định danh trong phân loại học đóng vai trò quan trọng vào việc xác định sự đa dạng các loài cá trong tự nhiên. Theo truyền thống, phƣơng pháp định danh dựa trên các đặc điểm hình thái là phƣơng pháp đã đƣợc phát triển lâu đời và có độ tin cậy. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp có thể khó phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa những loài có quan hệ gần, do có sự giới hạn về một số đặc trƣng về hình thái học, đặc biệt khi mẫu vật là cá bột, hơn nữa công tác bảo quản mẫu cá cũng có thể làm thay đổi màu sắc tự nhiên của cá dẫn đến khó khăn khi phân loại một số lƣợng lớn mẫu trong thời gian dài. Gần đây, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học phân tử, nhiều chỉ thị sinh học phân tử đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhƣ là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác định danh các loài cá. Định danh các loài cá dựa vào vật liệu di truyền cho độ chính xác cao. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp định danh trên cơ sở phân tích DNA bộ gen thƣờng gặp một số khó khăn do bộ gen có kích thƣớc lớn, một gen có thể có nhiều bản sao trên nhiều locus, mỗi locus có nhiều allen khác nhau ... Mặt khác, cá chịu ảnh hƣởng trực tiếp bởi môi trƣờng, nên có thể mang nhiều biến dị di truyền trên DNA bộ gen làm cho việc phân tích kết quả lại gặp càng nhiều khó khăn. Các chỉ thị phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thƣờng là những trình tự có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến dị khác biệt giữa các loài, vì thế các gen mã hóa ribosomal RNA (rRNA) là một ứng viên tốt dùng định danh các loài sinh vật. Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu công bố về phân loại cá dựa vào bộ gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi bƣớc đầu “Ứng dụng khóa 2 phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ Pangasiidae”. Nhằm hỗ trợ định danh một số loài cá có giá trị kinh tế quan trọng thuộc họ Pangasiidae trong khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long. 1.2. Mục tiêu đề tài Ứng dụng một số chỉ tiêu trong hệ thống phân loại hình thái vào phân loại cá bột thuộc họ Pangasidae để xác định số lƣợng và tỷ lệ các loài Pangasianodon hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema trong các mẫu thu đƣợc từ tháng 6/2006 đến