Khóa luận Ứng dụng phương pháp in situ hybridization để chẩn đoán mầm bệnh wssv (white spot syndrome virus) trên tôm sú (penaeus monodon) và tsv (taura syndrome virus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus Vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giải đáp những khó khăn, vƣớng mắc trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. CN. Phạm Văn Điền và CN. Hứa Đức Quới đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. TS. Lý Thị Thanh Loan và ThS. Đinh Thị Thủy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị làm việc tại phòng Mô Học, phòng Sinh Học Phân Tử và phòng Chất Lƣợng Nƣớc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cô Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú Yên đã giúp tôi thu mẫu hoàn thành đề tài. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Thành phố HCM, tháng 9 năm 2005 Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh iv TÓM TẮT PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 9 – 2005. ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO. Đề tài đƣợc thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tƣợng là TSV trên P. vannamei (Postlarvae và thƣơng phẩm) và WSSV trên P. monodon (Postlarvae và thƣơng phẩm). Hai loại virus này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng, để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại dịch bệnh này. Đề tài gồm các thí nghiệm sau: 1. Các thí nghiệm trên P. vannamei Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu, thực hiện trên 5 nghiệm thức. Kết quả nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe đƣợc biến tính trƣớc ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C; khi lai thì cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút, sau đó ủ mẫu qua đêm ở 420C) là tốt nhất trên postlarvae và tôm thƣơng phẩm.  Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ƣu với Proteinase K, thực hiện trên 5 nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. Kết quả thời gian cắt với Proteinase K tối ƣu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm thƣơng phẩm là 17 phút.  Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức: 100µl, 75µl và 50µl. Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm là 75µl. 2. Các thí nghiệm trên P. monodon Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy v rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm thay đổi một số hóa chất thông dụng nhƣ cồn tuyệt đối, xylene và paraformaldehyde do Việt Nam và Trung Quốc sản xuất, nhằm giảm chi phí chẩn đoán. Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt so với thí nghiệm dùng các hóa chất nhƣ bộ kit đã khuyến cáo sử dụng.  Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn. 3. Thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mô học và PCR Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên P. vannamei (postlarvae và tôm thƣơng phẩm) và P. monodon (postlarvae và tôm thƣơng phẩm). Kết quả thí nghiệm cho thấy phƣơng pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR. Từ các kết quả thực nghiệm nhƣ trên, chúng tôi đã đƣa ra quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng đƣợc việc kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa ............................................................................................................................ i Trang tựa ............................................................................................................................ ii Lời cảm tạ .......................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xi Danh sách các hình và các sơ đồ ....................................................................................... xii Danh sách các bảng ........................................................................................................... xiv CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................................. 1 I.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1 I.2 Mục tiêu đề tài .............................................................................................................. 2 I.3 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2 I.4 Nội dung của đề tài ...................................................................................................... 2 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................................. 3 II.1.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 3 II.1.2 Các hình thức nuôi ................................................................................................... 3 II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ..................................................................... 3 II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ................................................................................ 4 II.2.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 4 II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang đƣợc áp dụng .............................................................. 5 II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam .................................................................... 5 II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng ................................. 5 II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei.......... 5 II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng ..................................................... 6 vii II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú ............................................................................... 6 II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng ............................................................ 7 II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng ................................................... 7 II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú ............................................................................. 7 II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng .......................................................... 7 II.3.4 Dinh dƣỡng .............................................................................................................. 7 II.3.4.1 Dinh dƣỡng của tôm sú ......................................................................................... 7 II.3.4.2 Dinh dƣỡng của tôm thẻ chân trắng ...................................................................... 8 II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển ................... 8 II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8 II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD .............................................................................................. 8 II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 8 II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 11 II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh ...................................................................... 11 II.4.1.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 12 II.4.1.5 Phòng bệnh ........................................................................................................... 12 II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) ................................................................ 12 II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 12 II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 13 II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh ................................................................................... 14 II.4.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 14 II.4.2.5 Phòng và trị bệnh .................................................................................................. 14 II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ......................................................... 14 II.5.1 Sơ lƣợc về phƣơng pháp In situ hybridization ......................................................... 14 II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử .................................................................................... 15 II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử ........................................................................................... 16 II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA ......................................................... 16 II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA ..................................... 16 II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lai phân tử ................................................................. 17 viii II.5.5 Probe ........................................................................................................................ 17 II.5.5.1 Khái niệm .............................................................................................................. 17 II.5.5.2 Các loại probe ............................................................................................ 18 II.5.5.3 Các phƣơng pháp đánh dấu probe ............................................................. 18 II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai ........................... 19 II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH ............................................................................. 23 II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc ................................................................................................. 23 II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể .......................................................................................... 23 II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô ............................................................................................ 24 II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH ...................................................................................... 25 II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản.............................. 25 II.5.8.1 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng và Taura .................................. 25 II.5.8.2 Ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản .............................................................................................................................. 26 II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này .............................................................. 26 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ...... 27 III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................................. 27 III.2 Vật liệu sinh học ........................................................................................................ 27 III.3 Hóa chất thí nghiệm ................................................................................................... 27 III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ ................................. 27 III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán ................................... 28 III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................................................. 28 III.4.1 Thiết bị thí nghiệm ................................................................................................. 28 III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm ................................................................................................ 29 III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit ................................... 29 III.5.1 Chuẩn bị hóa chất ................................................................................................... 29 III.5.2 Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 30 III.5.2.1 Cố định mẫu ........................................................................................................ 30 ix III.5.2.2 Cách xử lý mẫu .................................................................................................... 30 III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin ....................................................................................... 31 III.5.2.4 Cắt mẫu ................................................................................................................ 31 III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit ............................................................................. 31 III.5.3.1 Ngày thứ nhất ...................................................................................................... 31 III.5.3.2 Ngày thứ hai ........................................................................................................ 32 III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 34 III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu ............................................................................................. 34 III.6.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 34 III.6.2.1 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei ............................................................................................................. 35 III.6.2.2 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon ............................................................................................................................ 36 III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với mô học và PCR ............... 39 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei ........................................................... 41 IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH ............. 41 IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P. vannamei ......................... 43 IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai ............................. 43 IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K ............. 46 IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp ..................................... 49 IV.2 Kết quả trên tôm sú P. monodon ............................................................................... 52 IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp ........................ 52 IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm ............................................................................................................... 54 IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit..................................................................... 54 IV.2.2.2 Trƣờng hợp xử lý mẫu nhanh .............................................................................. 56 IV.2.2.3 Trƣờng hợp biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai ............................................... 59 x IV.2.2.4 Trƣờng hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai ........................................................................................................................ 61 IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR ..................................