Khóa luận Xác định tác nhân và khảo sát hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC MỘT SỐ LOẠI THUỐC HOÁ HỌC TRONG PHÒNG TRỪ THỐI NHŨN TRÁI THANH LONG (HYLOCEREUS UNDATUS L.) Giáo viên hướng dẫn: TS. Võ Thị Thu Oanh Ths. Nguyễn Thành Hiếu Sinh viên thực hiện: Phạm Quốc Vinh Nội dung báo cáo Phần 1: Mở đầu Phần 2: Vật liệu và phương pháp thí nghiệm Phần 3: Kết quả Phần 4: Kết luận và đề nghị Phần 1: Mở đầu 1 Đặt vấn đề Thanh long đem lại hiệu quả kinh tế cao và nâng cao thu nhập đáng kể cho nông dân ở các vùng trồng. Thời gian gần đây, trong thực tế sản xuất đã xuất hiện một loại dịch hại mới gây ảnh hưởng không nhỏ cho cây thanh long, đó là bệnh thối nhũn trái thanh long. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên đề tài “Xác định tác nhân và khảo sát hiệu lực một số loại thuốc hoá học trong phòng trừ bệnh thối nhũn trái thanh long (Hylocereus undatus L.)” được thực hiện. Mục đích và yêu cầu 2 Mục đích ➢ Xác định tác nhân gây bệnh thối trái thanh long và khảo nghiệm một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh. 3 Yêu cầu ➢ Xác định và phân lập tác nhân gây bệnh thối nhũn trái. ➢ Khảo nghiệm tìm ra loại thuốc phòng trị bệnh thối nhũn trái hiệu quả. Phần 2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1. Thời gian và địa điểm thực hiện 2. Vật liệu 3. Phương pháp Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: ✓Đề tài được thực hiện từ tháng 02 đến tháng 07 năm 2011. Địa điểm thực hiện: ✓Thí nghiệm thuốc ngoài đồng: thực hiện tại Quơn Long – Chợ Gạo – Tiền Giang. ✓Chủng Koch và thí nghiệm khác: thực hiện tại Viện Cây Ăn Quả Miền Nam. Vật liệu • Phân lập, nuôi cấy: đĩa petri, môi trường nuôi cấy PDA và NA, giấy thấm, tủ cấy • Chủng Koch và thí nghiệm thuốc ngoài đồng: bình phun, kim tiêm y tế, bông y tế, kéo • Các dụng cụ quan sát nấm và vi khuẩn: kính hiển vi, lam, lamen, đèn cồn. Phương pháp 1. Phân lập, nuôi cấy 2. Giám định tác nhân nấm 3. Giám định tác nhân vi khuẩn 4. Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch 5. Phản ứng sinh hóa 6. Khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học ở điều kiện in vitro 7. Khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học ở điều kiện ngoài đồng 1. Phân lập, nuôi cấy Thu mẫu bệnh: ● Được thu thập ở những bông trái có biểu hiện rõ ràng, đựng riêng trong túi nylon, ghi rõ nơi thu, thời gian thu. ● Mỗi vườn thu 2 – 3 trụ, mỗi trụ 1-2 trái. Xử lý mẫu: ● Mẫu được lau sạch bằng cồn 700. ● Cắt thành từng mảnh 2x2mm,xử lý lại bằng cồn và nước cất. ● Cấy vào môi trường NA, PDA và đặt ở nhiệt độ phòng quan sát. Giám định tác nhân nấm ➢Nấm sau khi được phân lập và giữ mẫu trên môi trường PDA để quan sát và giám định Phương pháp giám định: ➢Được thực hiện theo tài liệu của Clements (1973) ➢Quan sát tơ nấm, hạch nấm, bào tử bằng kính hiển vi. Giám định tác nhân vi khuẩn - Dựa vào hình dạng, phản ứng khi nhuộm gram, hình dạng khuẩn lạc - Dựa vào các phản ứng sinh hóa định danh cho từng loài vi khuẩn riêng biệt như: khử citrate, phân hủy tinh bột, catalase.theo tài liệu của N.S.Schaad (1988). Kiểm chứng tác nhân thông qua quy trình Koch Mục đích: kiểm chứng lại tác nhân gây bệnh. Địa điểm: tại trại thực nghiệm – Viện Cây Ăn Quả Miền Nam Phương pháp: ● Chủng riêng từng loại vi khuẩn được pha sẵn ở nồng độ 3,6.10-6 cfu/ml. ● Dùng ống tiêm y tế hút 1ml dung dịch chứa vi khuẩn và tiêm vào 20 nụ dưới 10 ngày tuổi và trái non mới rút râu. ● Bao nụ và trái lại để tránh nhiễm tác nhân bên ngoài. Phản ứng sinh hóa 1. Thủy phân tinh bột 2. Phản ứng Catalase 3. Khả năng phân giải citrate 4. Khả năng gây thối nhũn khoai tây Thủy phân tinh bột Vật liệu: môi trường tinh bột, ống nghiệm chứa nước cất khử trùng,, vi khuẩn cấy trên môi trường NA, giấy thấm được cắt sẵn hấp khử trùng (đường kính 0.5cm), dung dịch Lugol Iodine. Phương pháp Hòa khoanh khuẩn ty vào ống nghiệm nước cất, lắc đều. Cho giấy thấm vào ống nghiệm chứa dịch khuẩn, vớt ra và cấy vào đĩa môi trường tinh bột đã chuẩn bị sẵn, ủ 5 trong 5 ngày. Dùng pipett rút 5ml Lugol Iodine cho vào vừa ngập đĩa petri và quan sát. Kết quả: dương tính nếu khuẩn lạc không bắt màu, âm tính khi khuẩn lạc có màu nâu. Phản ứng Catalase - Vi khuẩn được nuôi từ 18 -24 giờ trên môi trường NA - Dùng que cấy dích khuẩn lạc của vi khuẩn đặt lên lam kính - Cho một giọt hydrogen peroxide 3% (H2O2) vào khối vi khuẩn và quan sát. - Kết quả: có sủi bọt khí chứng tỏ phản ứng catalase dương tính và ngược lại. Khả năng phân giải citrate Vật liệu: môi trường Simmon’s Citrate Agar, ống nghiệm Phương pháp: ● Môi trường được chuẩn bị sẵn đổ vào ống nghiệm và hấp khử trùng. ● Sau khi cấy vi khuẩn, đặt các ống nghiệm ở điều kiện nhiệt độ phòng và quan sát kết quả sau 4 ngày. ● Kết quả được quan sát thông qua sự thay đổi màu, nếu phản ứng dương tính thì màu sắc của môi trường sẽ chuyển sang màu xanh da trời và ngược lại (màu xanh lá cây). Khả năng gây thối nhũn khoai tây Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Phương pháp - Khoai tây được rửa sạch sau đó cắt ra từng mảnh dày khoảng 7 – 8 mm. - Đặt mảnh khoai tây vào đĩa petri được giữ ẩm bằng mảnh giấy thấm vô trùng có thấm ướt bằng nước cất vô trùng. - Dùng dao mổ vô trùng tạo một rảnh sâu khoảng 3 – 4 mm và chủng vi khuẩn vào rảnh được tạo đó, quan sát kết quả sau 24 giờ. 6. Khảo sát hiệu quả của một số loại thuốc hoá học ở điều kiện in vitro Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, có 3 lần lập lại, mỗi lần lập lại tối thiểu 3 đĩa, nồng độ thuốc theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm Không xử lý thuốcĐối chứng 3.6.10-6 cfu/mlBacillus 10gr/8LNorshield 86,2WP 8gr/8LKasuran 47WP 15gr/16LPoner 40T 30gr/8LAvalon 8WP 10ml/10LDitacin 8L 10gr/10LStarner 20WP Nồng độ xử lýNghiệm thức Phương pháp Thuốc được chuẩn bị trước và pha vào môi trường trước khi đổ vào đĩa petri. Sau 24 giờ tiến hành cấy vi khuẩn vào và theo dõi sau 24, 48, 72 và 96 giờ. Chỉ tiêu theo dõi: ➢Đo đường kính vùng vô khuẩn. ➢Phân cấp khả năng kháng thuốc theo thang đánh giá của Paige và ctv (1988). Bảng phân cấp khả năng kháng thuốc theo thang đánh giá của Paige và ctv (1998) > 16 mm4 11 -15 mm3 6 -10 mm2 1 -5 mm1 0 mm0 Đường kính vùng vô khuẩn (mm)Cấp 7. Nghiên cứu hiệu quả quản lý tổng hợp bệnh bằng một số loại thuốc ở điều kiện ngoài đồng - Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, 09 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 trụ thanh long. - Nồng độ xử lý thuốc theo khuyến cáo của nhà sản xuất, phun 4 lần mỗi lần cách nhau 4 ngày khi bông trái 8 – 10 ngày tuổi. - Lấy chỉ tiêu trên mỗi trụ thanh long theo 4 hướng khác nhau, mỗi trụ theo dõi 10 bông trái. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh. Tỷ lệ bệnh tính theo công thức Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1995. Tỷ lệ bệnh (%) = (số trái bệnh / tổng số trái quan sát) x 100 Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm theo nông dânĐối chứng 3.6.10-6 cfu/mlBacillus 8gr/8 LKasuran 47WP 15gr/16 LCoc 85WP 15gr/16 LPoner 40T 10ml/10 LBiogreen 20-30gr/8 LAvalon 8WP 10ml/ 10 LDitacin 8L 10gr/10 LStarner 20WP Nồng độ xử lýNghiệm thức Sơ đồ bố trí thí nghiệm 9 3 6 4 2 1 5 7 8 5 2 8 1 6 8 4 7 3 7 4 5 3 6 2 8 1 9 Chiều biến thiên Phần 3:Kết Quả 1. Phân lập tác nhân gây bệnh Bảng 3.1: Kết quả phân lập mẫu bệnh ở Tiền Giang và Long An 70,76Nấm 68,46Vk5 10,76Vk4 9,23Vk3130 15,38Vk2 12,30Vk1 Tỷ lệ (%)Tác nhânSố lượng mẫu cấy (trái) Kết quả bảng 4.1 cho thấy có 6 tác nhân phân lập được trên mẫu trái thanh long, trong đó có 5 dòng vi khuẩn và 1 loại nấm. Trong 130 mẫu trái thì nấm chiếm tỷ lệ cao nhất 70,76% và Vk5 68,46% so với các tác nhân còn lại (Vk1, Vk2, Vk3, Vk4). Kết quả chủng Koch ngoài đồng 020Vk4 2020Vk5 020Vk3 020Vk2 020Vk1 Số lượng bông thốiSố lượng bông chủngTác nhân Ghi chú: Vk vi khuẩn Bảng 3.2: Kết quả chủng Koch ngoài đồng Qua bảng 4.2 cho thấy dòng vi khuẩn Vk5 gây thối trên bông thanh long với tỷ lệ 100% bông đều bị thối chứng tỏ vi khuẩn Vk5 là tác nhân gây thối nhũn đầu trái thanh long. Các dòng vi khuẩn còn lại không thấy có hiện tượng thối xảy ra. 2. Kết quả chủng Koch ngoài đồng Triệu chứng chủng vi khuẩn 5Triệu chứng ngoài đồng 3. Kết quả phản ứng sinh hóa Sau khi cho tế bào vi khuẩn nuôi 24 giờ tuổi lên lam sạch và nhỏ một giọt H2O2 vào thì có hiện tượng sủi bọt khí từ khối vi khuẩn, cho thấy vi khuẩn có enzym catalase phù hợp với kết quả của Schaad (1998). 3. Kết quả phản ứng sinh hóa Sau khi nhuộm với dung dịch Iodine do tinh bột kết tủa với iot có màu nâu, sự xuất hiện vùng sáng không có kết tủa tinh bột với iot chứng tỏ vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột. Sau khi nhuộm Lugol Phân giải citrate Sau 4 ngày cấy trên môi trường Cimmon’s Citrate Agar dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate cho kết quả dương tính, kết quả được quan sát thông qua sự đổi màu môi trường từ xanh lá sang xanh lục. Sau 4 ngày chủng Thí nghiệm gây thối nhũn khoai tây Sau 24 giờ chủng vi khuẩn và quan sát kết quả thấy có hiện tượng thối đen xung quanh vùng chủng vi khuẩn cho thấy vi khuẩn 5 có khả năng gây thối nhũn khoai tây. Triệu chứng thối sau 24 giờ chủng Kết quả phản ứng sinh hóa + Gây thối nhũn khoai tây 4 + Khả năng phân hủy citrate 3 + Khả năng thủy phân tinh bột 2 + Phản ứng Catalase 1 Ghi chúĐặc điểmSTT Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính Kết quả phản ứng sinh hóa Phản ứng Catalase dương tính phù hợp với kết quả giám định vi khuẩn theo Schadd (1988), Goszcynska (2000). Khả năng gây thối nhũn khoai tây ở kết quả thí nghiệm được trình bày cũng phù hợp với kết quả của Goszcynska (2000) nói về khả năng gây thối nhũn khoai tây trong giám định vi khuẩn Erwinia sp. ở điều kiện phòng thí nghiệm. Tóm lại: qua kết quả giám định có thể kết luận dòng vi khuẩn Vk5 thuộc chi vi khuẩn Erwinia sp. dựa vào một số đặc điểm trên. Nhuộm gram, quan sát hình dạng vi khuẩn và nấm Hình : Hình dạng vi khuẩn nhuộm gram Hình : Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn Hình Bào tử nấm Rhizopus sp. Hình Nấm Rhizopus nuôi cấy trên PDA 4. Kết quả khảo sát hiệu quả một số loại thuốc hoá học ở điều kiện in vitro 1,72 1,94 0,52 0,66 CV% ** ** ** ** Mức ý nghĩa 7,60 a 7,07 a 6,53 a 6,13 aĐối chứng 7,33 b 7,07 a 6,50 a 5,57 b Bacillus 5,00 c5,00 b5,00 b5,00 c Norshield 86.2WP 5,00 c5,00 b5,00 b5,00 c Kasuran 47WP 5,00 c5,00 b5,00 b5,00 c Poner 40T 5,00 c5,00 b5,00 b5,00 c Avalon 8WP 7,60 a7,07 a6,53 a6,13 aDitacin 8L 5,00 c 5,00 b 5,00 b 5,00 c Starner 20WP 4 NSC3 NSC2 NSC1 NSC Đường kính vòng vô khuẩnNghiệm thức Mức độ kháng của vi khuẩn đối với từng nghiệm thức 2211Đối chứng 2211Bacillus 0000Norshield 86.2WP 0000Kasuran 47WP 0000Poner 40T 0000Avalon 8WP 2211Ditacin 8L 0000Starner 20WP 1NSC1NSC1NSC1NSC Phân cấp vòng vô khuẩnNghiệm thức 5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học đến tỷ lệ bông thối 11,81 14,38 CV(%) ** ** Mức ý nghĩa 29,17 a 25,42 aĐối chứng 21,10 ab 14,62 b Bacillus 15,56 b 9,25 bc Coc 85WP 18,05 b 0,00 d Kasuran 47WP 6,86 c 5,28 c Poner 40T 0,00 d 0,61 d Biogreen 0,00 d 4,66 c Avalon 8WP 0,00 d 5,71 c Ditacin 8L 27,84 a 33,04 aStarner 20WP Sau phun lần 4Sau phun lần 3 Tỷ lệ bông thối (%)Nghiệm thức Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN Trong 6 tác nhân phân lập được trên trái thanh long có 1 dòng vi khuẩn là tác nhân chính và 1 nấm là tác nhân phụ gây bệnh thối nhũn đầu trái thanh long. Qua giám định theo tài liệu của Clements (1973) thì nấm phân lập được là nấm Rhizopus sp. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi khi nhuộm gram có dạng hình roi, gram âm có tên là Erwinia sp.(Shchaad, 1988 và Goszcynska, 2000). Các loại thuốc Ditacin , Avalon và Biogreen có hiệu quả rất tốt làm giảm tỷ lệ bông thối ở điều kiện ngoài đồng. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 2. ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục tiến hành thêm các thí nghiệm để định danh được vi khuẩn gây thối nhũn trái thanh long. Tiến hành thí nghiệm nhiều loại thuốc hơn trong phòng trị bệnh thối đầu trái thanh long. Phun các loại thuốc Ditacin , Avalon và Biogreen có kết hợp với rút râu sớm sau khi hoa nở (thụ phấn hoàn toàn) trong điều kiện mùa mưa sẽ làm giảm tỷ lệ bệnh. Cám ơn thầy cô và các bạn đã chú ý theo dõi !